Amplifikation von Prionen in vitro

Die Arbeit „Amplifikation von Prionen in vitro“ beruhte auf der
Amplifikationsmethode die erstmals 2001 vorgestellt wurde (Saborio
et al., 2001). Bei der PMCA wird erstmals PK-resistentes PrPres in
ausreichender Menge in vitro hergestellt, welches
molekularbiologisch dem Erreger spongiformer Enzephalopathien
gleicht. Die PMCA erlaubt somit eine in vitro Untersuchung des
pathologischen Umfaltungsprozess von PrPC zu PrPSc für
diagnostische und therapeutische Studien. In dieser Arbeit wurden
ausgiebig die Einzelschritte der PMCA Methode, insbesondere die
Quantifikation der Western Blot Bande und die Auswirkungen der
Sonifikationsleistung und der Inkubationszeit auf die
Amplifikationseffizienz untersucht. Je nach Stärke der
Sonifizierung ändert sich die Effizienz der PMCA Reaktion
(Kap.‎3.1.2) . Eine Amplifikation ohne Sonifikation ist möglich,
scheint aber nicht autokatalytisch aktives PrPres zu erzeugen und
erfüllt somit nicht die Prion Hypothese ‎3.1.3 und ‎4.1). Neues
PrPres kann als seed für weitere Amplifikationen dienen (Kap.
‎3.1.6). Parallelansätze zeigten die Reproduzierbarkeit der PMCA,
so dass vergleichende Studien mit unterschiedlichen
Reaktionsansätzen einen Vergleich der Amplifikationseffizienz
ermöglichen (Kap ‎3.1.5). Die Intensitätsmessung von Western Blot
Banden repräsentiert die Proteinmenge in vitro (Kap. ‎2.2.6). Es
konnte gezeigt werden, dass PrPC und PrPSc essentiell für die
Durchführung der Reaktion sind. Somit konnte gezeigt werden, dass
die PMCA im Einklang mit der Prionhypothese steht, die besagt, dass
ein pathogener PrPSc-Seed die Umfaltung von nativem PrPC initiiert.
(Kap ‎3.1.4 und ‎3.2). Die molekulare Spezifität der PMCA Reaktion
wurde hervorgehoben durch die Erkenntnis, dass rPrP die
Amplifikation in vitro hemmt (Kap. ‎3.2, Bieschke et al., 2004).
Prion Proteine binden Kupfer in vivo (Brown et al., 1997a) und in
geringerer Affinität auch Ni, Mn und Zn (Jackson et al., 2001). Die
Rolle von Metallen bei der Konversion von PrPC zu PrPSc ist noch
nicht endgültig geklärt. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt,
dass bei Zugabe von Mn, Ni und Zink in ca. 10fach physiologischen
Konzentrationen von 50µM und unphysiologischen 500µM die PrPres
Amplifikation gefördert wird, während Cu keinen Effekt zeigt (Kap.
‎3.3.1). Gleichzeitig verringern alle Metallionen die Stabilität
von neu entstandenem PrPres gegenüber PK (Kap. ‎3.3.2). Man kann
sich den destabilisierten Zustand als ein Metallgebundenes
PrP-Zwischenprodukt in der Umfaltung von PrPC zu PrPSc vorstellen
(Sarafoff et al., 2005). Die PMCA Reaktion wie von Saborio et al.
beschrieben hat einige Nachteile. Man arbeitet mit infektiösem
Material in einem offenen System und verursacht eine Kontaminaton
der Sicherheitswerkbank. Es wurden zwei Systeme zur automatischen
Amplifikation im geschlossenen System entwickelt. Der
Wasserbadamplifikator sonifizierte zyklisch das temperierte Becken
in dem die Proben in einem Schwimmer genau positioniert wurden
(Kap. ‎3.4.1). Es zeigte sich eine maximale Amplifikation von
14fach in der Mitte des Bades wohingegen die Konversionseffizienz
zum Rand des Beckens hin gleichmäßig absank (Kap ‎3.4.2). Aufgrund
der inhomogenen Ergebnisse mit dem Wasserbad wurde mit einem
Microplate Horn der Munich Prion Cycler entwickelt, wo der gesamte
Boden des Beschallungsbeckens vom Abstrahlkopf der
Ultraschallsonotrode besteht, so dass eine homogene
Leistungsverteilung erwartet wurde. Die Proben befanden sich in
einer mit Plastikfolie versiegelten Mikrotiterplatte, so dass
Verluste und Kontaminationen ausgeschlossen werden konnten (Kap.
‎3.4.3). Es konnte eine gleichmäßigere Amplifikation von 3,0 ± 0,7
gezeigt werden, wobei kein Abfall der Faktoren am Rand der Platte
festzustellen war (Kap. ‎3.4.4). Es konnte mit den beiden hier
vorgestellten Systemen zum ersten Mal eine Amplifikation von PrPres
mit indirekter Sonifikation von verschlossenen Proben und dem
Einfluss der Ultraschallleistung auf die Amplifikation gezeigt
werden (Sarafoff et al., 2005). Dies zeigte auch, dass die
Metalloberfläche der Sonotrode bei der manuellen PMCA keine
katalytische Funktion bei der Konversion des Kupferbindenden PrPC
zu PrPres innehat. Der Munich Prion Cycler ermöglicht eine homogene
Amplifikation von Parallelproben im Mikrotiterformat. Die
Entwicklung der ELISA Technologie zur Quantifizierung von PrP in
Homogenaten wird in Zukunft ein limitierender Schritt in der
Automatisierung der PMCA Reaktion sein (Kap. ‎2.2.7 und ‎4.4).