Bedeutung der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit in der Pathogenese der, Philadelphiatranslokation Bcr-Abl positiven, chronischen myeloischen Leukämie

Die vorliegende Arbeit beschreibt die durchgeführten Experimente
zur Charakterisierung der molekularen Assoziation der
Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit mit dem Onkoprotein Bcr-Abl. Es wird
in der zeitlichen Abfolge der chronisch myeloischen Leukämie (CML)
besonders für die chronische Phase eine Beteiligung des
Stammzellfaktors (SCF), dem natürlichen Liganden von c-Kit, an der
Proliferation des malignen Zellklons vermutet. Ob hierbei eine
Stimulierung durch SCF wesentlich ist, oder ob der Rezeptor von
intrazellulärer Seite durch Bcr-Abl stimuliert wird ist eine
wichtige Frage für das Verständnis der Progression der CML. Um
diese Frage zu beantworten, wurden Expressionssysteme in
Säugetierzellen und Insektenzellen optimiert, um eine hohe
Produktion von c-Kit zu gewährleisten. Es wurde eine Koexpression
von c-Kit und Bcr-Abl hergestellt um gute Bedingungen in den
nachfolgenden Immunpräzipitationen (IP) zu schaffen. In diesen
Studien konnte eine Kopräzipitation von c-Kit und Bcr-Abl erstmals
nachgewiesen werden. Die Bindungspartner waren jeweils im
Western-Blot der IP nachweisbar, sowohl nach Präzipitation von
Bcr-Abl, als auch von c-Kit. Im Western-Blots konnte der Status der
Tyrosinphosphorylierung von c-Kit detektiert werden. Eindeutige
Hinweise auf die Aktivierung von c-Kit durch Bcr-Abl konnten durch
diese Experimente zum ersten Mal nachgewiesen werden.
Punktmutationen an funktionell relevanten Positionen in Bcr-Abl
änderten nichts an der gezeigten Interaktion, bis auf eine
Kinase-inaktive Mutante, die keine Phosphorylierung von c-Kit mehr
bewirkte. Um eine Bindungsstelle in c-Kit zu charakterisieren,
wurden dann Trunkationsmutanten von c-Kit hergestellt. Dabei wurde
der extrazelluläre Rezeptoranteil entfernt und immer kürzere
Mutanten, durch Entfernung einzelner struktureller Domänen von
N-terminal, hergestellt. Diese wurden in IPs mit Bcr-Abl
eingesetzt. Es konnte für sämtliche Mutanten eine Kopräzipitation
gezeigt werden, so dass eine Assoziationsstelle von c-Kit nicht
klar ermittelt werden konnte.