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24.06.2004
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Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es
ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu
invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren.
Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ
III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle
transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE
unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation,
stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die
Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP
sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET),
bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP
übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm
liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär
dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit
dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit
Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE
in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der
Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete
Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber
durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig
negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von
BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in
einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen
FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz
aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten
Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE
kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro
Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich
zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der
Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE.
Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die
fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von
YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.
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RNA (rRNA), die eine wichtige, primär funktionale Rolle in der
Zellphysiologie einnimmt. Die Gene dieser rRNA lassen sich in
hochkonservierte und hochpolymorphe Bereiche unterscheiden. Während
in den konservierten Regionen kaum Mutationen zu finden sind,
werden in den polymorphen Abschnitten je nach Grad der
Verwandtschaft große Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen
Tierarten beobachtet. Individuen einer Art zeigen diese
Unterschiede nicht. Somit können diese artspezifischen Abweichungen
dazu genutzt werden, biologische Materialien unbekannter Herkunft
einer bestimmten Tierart zuzuordnen. Mit der Amplifikation und
anschließenden Sequenzierung eines Bereiches innerhalb des
mitochondrialen 12S-Gens sowie der Auswertung bereits publizierter
Sequenzen gelingt die Identifizierung einer Spezies anhand von 20 –
25 Basen. Dazu kann neben der etablierten Methode der Sequenzierung
nach Sanger auch die Technik der Pyrosequenzierung genutzt werden.
Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit der Identifizierung
verschiedener Arten durch die Analyse kurzer Fragmente ihrer
12S-Gen-Sequenz. Dazu reicht die Amplifikation des gewünschten
Fragmentes mit Hilfe eines Primerpaares. Für degradierte DNA wurde
ein alternativer Rückprimer getestet, der die Amplifikation eines
kürzeren Sequenzabschnittes ermöglicht. Es wurden insgesamt 91
Proben verschiedener Tiere analysiert, die sich aus 8
Säugetier-Arten, 2 Fisch-Arten und 3 Vogel-Arten zusammen setzten.
Zudem kann und wird die Methode bereits bei Fragestellungen in der
forensischen Routine angewendet.
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In der vorliegenden Arbeit wurden therapeutische und
immunmodulatorische Effekte einer TNF-Blockade bei Patienten mit
aktiver Spondylitis ankylosans untersucht. Hierzu wurde an 10
Patienten während einer 60wöchigen Infliximabtherapie eine
Evaluation von Therapiewirksamkeit und -sicherheit, sowie eine
durchflusszytometrische Analyse der HLA-Oberflächenexpression auf
Lymphozyten vorgenommen. Von 8 Patienten wurde die Therapie ohne
ernste Nebenwirkungen gut vertragen und führte zur raschen und
dauerhaften Verbesserung der klinischen, laborchemischen und
radiologischen Verlaufsparameter. Ein Patient entwickelte nach
initialer Wirksamkeit ein sekundäres Therapieversagen, bei einem
weiteren Patienten wurde die Therapie unter dem Verdacht eines
medikamentös induzierten Lupus-Syndroms abgebrochen. Gegen Mitte
des Behandlungszeitraumes konnte ein am deutlichsten auf den
B-Lymphozyten ausgeprägter Anstieg der HLA-B27- und
MHC-Klasse-I-Expression beobachtet werden. Die Expressionszunahme
ist möglicherweise Ausdruck immunmodulatorischer Effekte, die mit
der langfristigen Therapiewirksamkeit assoziiert sind. Für die
Zunahme der Oberflächenexpression kommen folgende Mechanismen in
Frage: 1. eine vermehrte intravasale Kompartimentierung primär hoch
exprimierender Zellen oder 2. eine durch die TNF-Suppression
induzierte Hochregulation einer zuvor niedrigeren
HLA-B27-Oberflächenexpression. Angesichts unserer Ergebnisse und
der aktuell in der Literatur verfügbaren Daten halten wir letzteren
Mechanismus für wahrscheinlicher. Innerhalb dieses
Erklärungsmodells ist die bei Therapiebeginn niedrigere
HLA-B27-Expression bedingt durch die Expression einer verminderten
Anzahl von HLA-B27-Molekülen oder aberranter β2m-freier Varianten,
die durch die von uns verwendeten konformationsabhängigen
Antikörpern nicht detektierbar sind. Unter Hemmung des
TNF-Einflusses kommt es schließlich zur schrittweisen
Wiederherstellung der physiologischen Prozessierung trimolekularer
HLA-B27-Oberflächenantigene mit konsekutiv vermehrter AK-Bindung.
Eine verminderte oder aberrante HLA-B27-Expression ist
möglicherweise mit immunmodulatorischen Effekten im Sinne einer
erhöhten Zelldepletion assoziiert. Durch die Reexpression
trimolekularer HLA-B27-Moleküle wird die Interaktion zwischen
immunkompetenten Zellen und HLA-B27-positiven Zellen beeinflusst,
wodurch das Zellüberleben begünstigt wird. Dieser Erklärungsansatz
ist vereinbar mit dem gegenwärtig favorisierten pathogenetischen
Modell der fehlerhaften HLA-B27-Prozessierung und der derzeit
diskutierten Beteiligung von TNF bei der Manifestation der AS.
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Über diesen Podcast
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ausführlichen Bibliographien und mehr als 1000 Datenbanken reicht.
Auf iTunes U stellt die UB unter anderem eine Auswahl an
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bereit. (Dies ist der 2. von 19 Teilen der Sammlung 'Medizinische
Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU'.)
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