Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19 Archiv

In der vorliegenden Arbeit wurden therapeutische und immunmodulatorische Effekte einer TNF-Blockade bei Patienten mit aktiver Spondylitis ankylosans untersucht. Hierzu wurde an 10 Patienten während einer 60wöchigen Infliximabtherapie eine Evaluation von Therapiewirksamkeit und -sicherheit, sowie eine durchflusszytometrische Analyse der HLA-Oberflächenexpression auf Lymphozyten vorgenommen. Von 8 Patienten wurde die Therapie ohne ernste Nebenwirkungen gut vertragen und führte zur raschen und dauerhaften Verbesserung der klinischen, laborchemischen und radiologischen Verlaufsparameter. Ein Patient entwickelte nach initialer Wirksamkeit ein sekundäres Therapieversagen, bei einem weiteren Patienten wurde die Therapie unter dem Verdacht eines medikamentös induzierten Lupus-Syndroms abgebrochen. Gegen Mitte des Behandlungszeitraumes konnte ein am deutlichsten auf den B-Lymphozyten ausgeprägter Anstieg der HLA-B27- und MHC-Klasse-I-Expression beobachtet werden. Die Expressionszunahme ist möglicherweise Ausdruck immunmodulatorischer Effekte, die mit der langfristigen Therapiewirksamkeit assoziiert sind. Für die Zunahme der Oberflächenexpression kommen folgende Mechanismen in Frage: 1. eine vermehrte intravasale Kompartimentierung primär hoch exprimierender Zellen oder 2. eine durch die TNF-Suppression induzierte Hochregulation einer zuvor niedrigeren HLA-B27-Oberflächenexpression. Angesichts unserer Ergebnisse und der aktuell in der Literatur verfügbaren Daten halten wir letzteren Mechanismus für wahrscheinlicher. Innerhalb dieses Erklärungsmodells ist die bei Therapiebeginn niedrigere HLA-B27-Expression bedingt durch die Expression einer verminderten Anzahl von HLA-B27-Molekülen oder aberranter β2m-freier Varianten, die durch die von uns verwendeten konformationsabhängigen Antikörpern nicht detektierbar sind. Unter Hemmung des TNF-Einflusses kommt es schließlich zur schrittweisen Wiederherstellung der physiologischen Prozessierung trimolekularer HLA-B27-Oberflächenantigene mit konsekutiv vermehrter AK-Bindung. Eine verminderte oder aberrante HLA-B27-Expression ist möglicherweise mit immunmodulatorischen Effekten im Sinne einer erhöhten Zelldepletion assoziiert. Durch die Reexpression trimolekularer HLA-B27-Moleküle wird die Interaktion zwischen immunkompetenten Zellen und HLA-B27-positiven Zellen beeinflusst, wodurch das Zellüberleben begünstigt wird. Dieser Erklärungsansatz ist vereinbar mit dem gegenwärtig favorisierten pathogenetischen Modell der fehlerhaften HLA-B27-Prozessierung und der derzeit diskutierten Beteiligung von TNF bei der Manifestation der AS.

RNA (rRNA), die eine wichtige, primär funktionale Rolle in der Zellphysiologie einnimmt. Die Gene dieser rRNA lassen sich in hochkonservierte und hochpolymorphe Bereiche unterscheiden. Während in den konservierten Regionen kaum Mutationen zu finden sind, werden in den polymorphen Abschnitten je nach Grad der Verwandtschaft große Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Individuen einer Art zeigen diese Unterschiede nicht. Somit können diese artspezifischen Abweichungen dazu genutzt werden, biologische Materialien unbekannter Herkunft einer bestimmten Tierart zuzuordnen. Mit der Amplifikation und anschließenden Sequenzierung eines Bereiches innerhalb des mitochondrialen 12S-Gens sowie der Auswertung bereits publizierter Sequenzen gelingt die Identifizierung einer Spezies anhand von 20 – 25 Basen. Dazu kann neben der etablierten Methode der Sequenzierung nach Sanger auch die Technik der Pyrosequenzierung genutzt werden. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit der Identifizierung verschiedener Arten durch die Analyse kurzer Fragmente ihrer 12S-Gen-Sequenz. Dazu reicht die Amplifikation des gewünschten Fragmentes mit Hilfe eines Primerpaares. Für degradierte DNA wurde ein alternativer Rückprimer getestet, der die Amplifikation eines kürzeren Sequenzabschnittes ermöglicht. Es wurden insgesamt 91 Proben verschiedener Tiere analysiert, die sich aus 8 Säugetier-Arten, 2 Fisch-Arten und 3 Vogel-Arten zusammen setzten. Zudem kann und wird die Methode bereits bei Fragestellungen in der forensischen Routine angewendet.

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren. Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als einzigen Effektor transloziert. Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern) durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien. Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP („GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42 hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho- GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in primären Makrophagen nachgewiesen. Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999). Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen

Bei Kindern mit erhöhtem Hirndruck infolge eines Hydrocephalus oder eines Schädelhirntraumas wurden die frühen akustisch evozierten Potentiale (FAEP) unter nicht labortechnischen Untersuchungsbedingungen abgeleitet. Die Kinder wurden in Gruppen unterteilt, je nach zugrunde liegender Störung (Hydrocephalus oder SHT) und erhöhtem Hirndruck und in Abhängigkeit des Alters (jünger als 3 Jahre und über 3 Jahre alt). Vor allem Veränderungen des Gesamtwellenbildes ließen auf Störungen im Verlauf der Hörbahn bei erhöhtem Hirndruck schließen. Diese äußerten sich in Deformierung der Wellen und Amplitudenreduktion bis hin zum vollständigen Verlust der Wellen. Bei Betrachtung der Einzelwellen zeigten sich die deutlichsten Amplitudenminderungen ebenfalls im Untersuchungskollektiv der Patienten mit erhöhtem intracraniellen Druck. Die Veränderungen äußerten sich dabei vor allem bei den Wellen II, IV, VI und VII, die als erste amplitudengemindert und deformiert wurden. Aber auch die Amplitude der Wellen I, III und V wurden deutlich durch ICP-Erhöhung beeinträchtigt. Zusammenfassend können die Untersuchungen der frühen akustisch evozierten Potentiale dann wertvolle Aussagen über die Integrität des auditorischen Systems im Verlauf des Hirnstammes oder Pathologien wie beispielsweise erhöhten intracraniellen Druck liefern, wenn erstens die Läsion direkt oder indirekt die Hörbahn tangiert, zweitens ein peripherer Hörschaden ausgeschlossen werden kann und FAEP-Voruntersuchungen des Patienten zum intraindividuellen Vergleich vorliegen.

60 Patienten (22 Frauen, 38 Männer), denen eine PEG aufgrund einer Schluckstörung (67% neurologische Erkrankung, 33% Tumorerkrankung) angelegt worden war, wurden über 1 Jahr (bei PEG-Anlage, Monat 1, 2, 3, 6, 9 und 12)hinsichtlich Ernährungsstatus und Lebensqualität (GLQI) untersucht. Komplikationen und Studienende wurden dokumentiert. Die Gesamtmortalität lag bei 65% Prozent, die Mortalität in den ersten 30 Tagen bei 21%. Leichte Komplikationen traten bei 53% der Patienten auf. Der Ernährunggszustand wurde mit der bioelektrischen Impedanzanalyse (BIA), dem Body-Mass-Index (BMI) und verschiedenen Laborparametern (Albumin, Eiweiß, Kalium, Calcium, Magnesium, Phosphat, Folsäure, Vitamin B12, Vitamin D, Vitamin E, Retinol, Zink) ermittelt. In allen Bereichen zeigten sich anfangs deutliche Ernährungsdefizite (BMI: 38%, BIA: 90%, Albumin: 49%, Eiweiß: 25%, Kalium: 17%, Calcium: 14%, Phosphat: 22%, Magnesium: 18%, Retinol: 78%, Vitamin E: 14%, Vitamin D: 37%, Folsäure: 16%, Vitamin B12: 4%, Zink: 46%). Außer Vitamin E und dem ECM/BCM-Index (BIA) lagen nach Ablauf einen Jahres alle Werte im Normalbereich. Die Lebensqualität wurde mit dem "Gastrointestinalen Lebensqualtätsindex" nach Eypasch (1993) untersucht. Sie war zu Beginn schon um 40% eungeschränkt und konnte im Verlauf der Studie stabil gehalten werden.

Es wurden zwei tierexperimentelle Versuchsaufbauten erarbeitet: 1.Die ex vivo perfusion isolierter Nieren von Macaca Fascicularis mit poliklonalem ATG 2.Perfusion der unteren Extremität von Macaca Fascicularis mit menschlichem Blut in einem geschlossenen Perfusionssystem Mit Hilfe der o.g. Aufbauten wurden folgende Fragestellungen untersucht: 1.Bindet poliklonales ATG im xenogenen konkordanten Modell an Strukturen der Niere von Macaca Fascicularis und 2.wird diese Bindung durch verlängerte Ischämiezeit moduliert? 3.Binden mononukleäre Zellen (Lymphozyten, Monozyten) an Gefrierschnitte der Niere von Macaca fascicularis und 4.wird diese Bindung durch vorherige Behandlung der mononukleären Zellen mit polyklonalem ATG moduliert? 5.Beeinflusst die Behandlung mit polyklonalem ATG das Adhäsionsverhalten menschlicher Lymphozyten bei der konkordanten Xenotransplantation und 6.gibt es diesbezüglich Unterschiede zwischen ATG-Fresenius und ATG-Mérieux? 7.Beeinflusst die Behandlung mit anti- IL-2 Rezeptor Antikörpern das Adhäsionsverhalten menschlicher Lymphozyten bei der konkordanten Xenotransplantation? 8.Ist die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG einer verzögerten Therapie im vorliegenden Ansatz überlegen? Die Ergebnisse im ersten Versuchsaufbau waren: 1.Polyklonales ATG bindet im konkordanten Modell Mensch zu Macaca Fascicularis nicht an Strukturen der Niere. 2.Eine verlängerte Ischämiezeit hat keinen Einfluss auf die Bindung von polyklonalem ATG an Strukturen der Niere von Macaca Fascicularis. 3.Mononukleäre Zellen binden nicht an nach kurzer Ischämiezeit entnommene, Gefrierschnitte der Niere von Macaca Fascicularis. 4.Eine vorherige Behandlung der Zellen mit polyklonalem ATG beeinflusst dieses Bindungsverhalten nicht. Die Ergebnisse im zweiten Versuchsaufbau waren: 1.Ohne vorherige Behandlung des menschlichen Blutes kommt es bereits nach etwa 15 Minuten zu einer weitgehend vollständigen Adhäsion humaner Leukozyten an das Gefäßendothel von Macaca Fascicularis. 2.Die Zugabe von polyklonalem ATG nach vollständiger Leukozytenadhäsion führt zu einer partiellen Aufhebung der Leukozyten-Endothel Interaktion. 3.Durch die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG kann im vorliegendem Versuchsaufbau eine Leukozyten-Endothel Bindung in 4 von 6 Fällen vollständig, und in 2 Fällen nahezu vollständig verhindert werden. 4.Die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG ist im vorliegenden Versuchsaufbau einer zeitversetzten Therapie überlegen. 5.Die prophylaktische Therapie mit anti- IL-2 Rezeptor Antikörpern hat im vorliegenden Versuchsaufbau keine positiven Effekte auf die Leukozyten-Endothel- Interaktion. Folgende klinische Hypothesen lassen sich aus den durchgeführten Experimenten ableiten: 1.Polyklonales ATG vermittelt keine direkte Wirkung durch Bindung an das Gewebe der Niere, unabhängig von der Ischämiezeit des transplantierten Organs. 2.Die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG ist wirksam bei der Verhinderung zellulärer Abstoßungsreaktionen und verbessert das Transplantatüberleben durch Vermeidung einer Immunisierung.

Es gilt heute als gesichert, dass eine starke genetische Komponente in der Ätiologie der Schizophrenie vorliegt. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer Fall-Kontroll-Assoziationsstudie drei genetische Polymorphismen in Genen des Interleukin-1-Genkomplexes auf eine mögliche Assoziation mit Schizophrenie untersucht: die Gene, die für die proinflammatorischen Interleukine Interleukin-1 alpha und Interleukin-1 beta kodieren, sowie das Gen, welches für den antiinflammatorischen Interleukin-1-Rezeptorantagonist kodiert. Dieser ist der natürlich vorkommende, endogene Gegenspieler von Interleukin-1. Seine biologische Funktion scheint in der Kontrolle des Ausmaßes der proinflammatorischen Interleukine zu liegen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Gene liegen innerhalb einer Genregion auf Chromosom 2p12-q22.1, die in einer groß angelegten Meta-Analyse als einziger Genabschnitt eine genomweite signifikante Kopplung erreichte (Lewis et al. 2003). Daher sind die Gene des Interleukin-1-Genkomplexes positionelle Kandidatengene in der Pathogenese der Schizophrenie. Außerdem sind die Interleukine deswegen sehr interessante Proteine für die Schizophrenie, da sie den Metabolismus von Neurotransmittern und die Hirnentwicklung beeinflussen sowie Informationen zwischen Zellen des peripheren Immunsystems und des zentralen Nervensystems vermitteln können. Im Blut, in der Zerebrospinalflüssigkeit sowie im präfrontalen Cortex schizophrener Patienten konnten veränderte Konzentrationen von IL-1 und IL-1RA im Vergleich zu Kontrollen beobachtet werden. Dies weist auf eine Dysregulation der Interleukine in der Schizophrenie hin. Da Anomalien bei der Hirnentwicklung, den Neurotransmittersystemen und dem Immunsystem als mögliche Pathomechanismen der Schizophrenie betrachtet werden, ist es durchaus vorstellbar, dass eine genetisch bedingte Störung in dem sensitiven Gleichgewicht zwischen pro- und antiinflammatorischen Interleukinen in der Schizophrenie zumindest teilweise krankheitsauslösend oder -beeinflussend sein kann. Für diese Fragestellung wurden Allel- und Genotypfrequenzen eines C-889T-Basenaustauschpolymorphismus im Promotor des Interleukin-1 alpha-Gens, eines C-511T-Basenaustauschpolymorphismus im Promotor des Interleukin-1 beta-Gens sowie eines variable number of tandem repeats (VNTR) -Polymorphismus im zweiten Intron des Interleukin-1-Rezeptorantagonist-Gens untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte keine Assoziation zwischen den untersuchten Polymorphismen der Gene des Interleukin-1 alpha und beta mit der Diagnose Schizophrenie festgestellt werden. Bei dem untersuchten Polymorphismus des IL-1RN konnte ein Trend in Richtung einer selteneren Häufigkeit des Allels 2 bei Schizophrenen nachgewiesen werden. Die Analyse von Haplotypen des IL-1-Genkomplexes auf Assoziation mit Schizophrenie ergab keinen Zusammenhang. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen dafür, dass das seltenere Vorkommen des Allels 2 des IL-1RA bei den Schizophrenen einen Einfluss auf das Entstehungsrisiko der Schizophrenie haben könnte, indem es zu einer Verschiebung der sensitiven Balance des Interleukin-1-Genkomplexes zwischen pro- und antiinflammatorischen Interleukinen zugunsten der proinflammatorischen Interleukine führt. Dieser Befund bekräftigt die Hypothese, dass eine überschießende Aktivierung des Immunsystems in der Pathogenese der Schizophrenie eine Rolle spielen könnte. Außerdem weist er darauf hin, dass die Dysregulation der Interleukine bei den Schizophrenen zumindest teilweise genetisch bedingt sein könnte. Die Ergebnisse sprechen somit für eine mögliche schützende Rolle des Allels 2 des Interleukin-1-Rezeptorantgonisten vor der Entstehung der Schizophrenie. Dieser Befund wurde durch neuste Studien von Zanardini et al. (2003) und Bocchio-Chiavetto et al. (2002), in denen die Träger des IL-1RN Allel 2 signifikant seltener bei den Schizophrenen vertreten waren, unterstützt.