Untersuchungen zur Produktion und Chaperoninteraktion von Yersinia YopE und SycE mittels Reporterfusionstechnologie

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es
ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu
invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren.
Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ
III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle
transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE
unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation,
stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die
Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP
sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET),
bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP
übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm
liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär
dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit
dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit
Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE
in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der
Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete
Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber
durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig
negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von
BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in
einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen
FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz
aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten
Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE
kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro
Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich
zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der
Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE.
Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die
fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von
YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.