Untersuchungen zur Struktur und Funktion der UL11- und UL20-Proteine des equinen Herpesvirus Typ 1

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der UL11- und
UL20-Homologe des equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1). Dabei sollte
vor allem auf deren Funktionen in späten Stadien des
Replikationszyklus und auf ein mögliches Zusammenspiel eingegangen
werden. Zunächst wurde das UL20-Protein identifiziert und sowohl
strukturell als auch funktionell charakterisiert. Ein in Kaninchen
hergestelltes Antiserum reagierte in Western Blot-Analysen
spezifisch mit zwei Proteinen mit apparenten Molekulargewichten von
25 und 75 kDa, und trotz zweier Konsensussequenzen im offenen
Leserahmen UL20 führte eine Hemmung der N-Glykosylierung des
Proteins zu keiner Veränderung dieser Laufeigenschaften. Das
Protein, das ab 6 h p.i. in Zellen nachweisbar war, wurde der
Klasse der γ1-Proteine zugeordnet und als Bestandteil der
Virushülle identifiziert. Eine Assoziation des UL20-Proteins mit
zellulären Membranen zeigte sich nach Fraktionierung infizierter
Zellen und nach Immunfluoreszenzfärbung UL20-exprimierender Zellen.
UL20-Deletionsmutanten der EHV-1-Stämme RacL11 und RacH wurden über
BAC-Mutagenese hergestellt. Die negativen Viren führten in
Einschritt-Wachstumskinetiken zu bis zu 1000fach geringeren
extrazellulären Titern als die entsprechenden Wildtyp-Viren. Die
intrazelluläre Infektiosität war dagegen nur um das 3fache
erniedrigt. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Funktion von pUL20
beim späten "viral egress" hin. Eine Bedeutung des Proteins im
"cell-to-cell-spread" wurde durch Untersuchung des Plaquephänotyps
gezeigt. Während die Ausgangsviren und Revertanten zu deutlichen
Plaques führten, bestanden die Plaques der Deletionsmutanten aus
nur wenigen infizierten Zellen. Eine initiale Charakterisierung des
UL11-Proteins von EHV-1 liegt bereits vor. Das Tegumentprotein, das
eine Konsensussequenz für eine N-Myristylierung aufweist,
assoziiert in infizierten Zellen mit Membranen und spielt eine
Rolle im "viral egress" und vor allem im "cell-to-cell-spread". Zur
genaueren Einordnung dieser Funktionen wurden die Auswirkungen der
Deletion des Großteils der UL11-spezifischen Sequenzen auf die
Replikation von EHV-1 in Zellkultur vor dem genetischen Hintergrund
verschiedener EHV-1-Isolate (RacL22, RacL11), -Stämme (KyA) und
-Mutanten (L11Δ49) untersucht. Sämtliche rekombinante Viren waren
auf nicht komplementierenden Zelllinien vermehrungsfähig. Das
UL11-Protein ist daher auch in Verbindung mit der Deletion der für
die Glykoproteine E und I kodierenden Gene (KyA) bzw. der fehlenden
Expression des UL49-Proteins für die Replikation von EHV-1 in
Zellkultur als nicht essentiell anzusehen. Die Bestimmung eines
Wachstumswertes der Deletionsmutanten und Ausgangsviren ergab
jedoch Hinweise auf eine mögliche Interaktion von pUL11 mit den
Glykoproteinen E und I bzw. dem Tegumentprotein pUL49. Die Funktion
des UL11-Proteins im "cell-to-cell-spread" konnte durch
Untersuchung des Plaquephänotyps, bei dem die UL11-deletierten
Viren zu deutlich kleineren Plaques als die Ausgangsviren führten,
bestätigt, jedoch nicht genauer definiert werden. Untersuchungen
eines in seiner Myristylierungs-Sequenz mutierten UL11-Proteins
ergaben weder eine Verschiebung der Laufeigenschaften im Western
Blot, noch eine veränderte Verteilung in der transfizierten Zelle.
Allerdings konnte eine Assoziation von pUL11 mit Lipid Rafts
gezeigt werden. Diese muss über eine Modifikation des Proteins
durch Myristylierung oder Palmitylierung vermittelt sein. Das
UL20-Protein dagegen war nicht spezifisch in den Lipid Rafts
angereichert. Von einem Zusammenspiel der beiden Proteine in diesen
Membranbereichen in ihrer Funktion beim "cell-to-cell-spread" ist
daher nicht auszugehen.