Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/07

In the present work, efferent ductules and epididymal duct from male foetuses as well as from sexually mature bulls were investigated using conventional light and electron microscopical techniques as well as glycohistochemical and immunohistochemical staining techniques. The prenatal development of the bovine epididymis was studied in foetuses ranging from 10 cm CRL (75 pcd) to 90 cm CRL (285 pcd). In foetuses with 10 cm CRL (75 pcd) the main event was the establishment of the urogenital junction between the extratesticular rete testis and mesonephric duct via the growing efferent ductules. At the foetal age of 110 pcd (24 cm CRL), efferent ductules underwent a strong coiling. At the same time the mesonephric duct began to lengthen and coil, forming three distinct regions, namely caput, corpus and cauda epididymidis. The coiling was much more distinct in caput and cauda than in corpus epididymidis. At 130 pcd (30 cm CRL) and upwards efferent ductules were organized in lobules which are then arranged in groups separated from each other by connective tissue septa. A similar organization involved the highly convoluted epididymal duct, particularly in the head and tail regions. In addition to the macroscopical modifications in the morphology of extratesticular excurrent duct system, histological differentiation involved both the tubular epithelium and the peritubular mesenchymal cells. The epithelium of efferent ductules was differentiated into ciliated and nonciliated columnar epithelium. The simple epithelium of the epididymal duct increased in height and developed stereocilia on its apical surface. Distribution of WGA-, PNA- and GSA-I-binding sites on luminal surface of the epithelium of efferent ductules, but not of epididymal duct may indicate earlier differentiation of the former. WGA-binding to the peritubular and interstitial mesenchymal cells, but not to the epididymal epithelium indicated that the mesenchymal structures differentiate before epithelial ones. S-100, FGF-1, FGF-2, ACE, laminin and GT were immunolocalized in the epithelium both of efferent ductules and epididymal duct as early as at 75 pcd (10 cm CRL). Also ?-SMA was immunolocalized in the peritubular mesenchymal cells at 75 pcd (efferent ductules) and at 95 pcd (epididymal duct, CRL 18 cm). The epithelium of the adult bovine efferent ductules is simple columnar including ciliated and nonciliated cells as well as some scattered intraepithelial leucocytes. On the basis of their cytological characteristics, nonciliated cells could be categorized into three sub-types. The epididymal duct of the adult bull is lined with pseudostratified columnar epithelium. It consists mainly of tall, slender, stereocilia-bearing columnar cells and small basal cells. On the basis of several morphometric parameters like epithelial height, luminal diameter and width of peritubular muscle coat the epididymal duct could be subdivided into six segments. Ultrastructural studies revealed a well developed Golgi apparatus, numerous profiles of sparsely granulated endoplasmic reticulum and mitochondria as well as rER in the cytoplasm of principal cells particularly in those of the first three segments. Apical surfaces of principal cells particularly those of the proximal segments were equipped with long stereocilia and their apical cell membrane and cytoplasm displayed a well developed endocytotic apparatus. The narrow basal extensions of principal cells were crowded with numerous pleomorphic mitochondria, lysosomes, heteromorphic electron dense granules and residual bodies. Basal cells were insinuated between the narrow basal extensions of principal cells and the basal lamina. They possessed kidney-shaped, mostly deeply-invaginated nuclei and were characterized by a paucity of organelles. Apical mitochondria-rich cells were frequently found in segments II and III and rarely in segments IV and V. Their hyaloplasm was lighter than that of the neighbouring principal cells and their apical surfaces were provided with short microvilli. Apart from a reasonable number of mitochondria, small Golgi apparatus and sporadic strands of rER, they displayed a paucity of organelles. Intraepithelial macrophages were occasionally encountered in the basal third of the epithelium. They possessed many mitochondria, well developed Golgi apparatus and rER as well as small heterochromatic nuclei. Various profiles of lysosomes and dark residual bodies were found in their cytoplasm. Intraepithelial lymphocytes were characterized by their heterochromatic, round and mostly indented nuclei and narrow peripheral cytoplasmic rim. They were often encountered in immediate proximity to subepithelial capillaries. Fluoresceinisothiocyanate (FITC)-labelled lectins (GSA-I, PNA, ECA, WGA, Con A, LCA, PSA, DBA, HPA, SBA, VVA, LTA and UEA-I) were also used for the study of the regional distribution of saccharide groups in adult bovine epididymal tissues. WGA, Con A, LCA, PSA, DBA and HPA bound distinctly to stereocilia of principal cells in the different segments. However, DBA- and HPA-binding sites were confined to stereocilia in caput region. WGA, LCA, PSA, DBA and HPA possessed distinct binding sites in Golgi zone of principal cells, mostly of the caput epididymidis. Basal cells reacted distinctly with WGA, Con A, LCA, PSA and HPA. Intraepithelial leucocytes displayed moderate binding sites for PNA, WGA, LCA and PSA. The basal membrane reacted moderately only with WGA. Epididymal connective tissue showed weak to moderate binding only with ECA and WGA. GSA-I bound distinctly to vascular endothelium and could be applied as a good marker for bovine endothelium. Sperm cell mass bound WGA and PNA distinctly. No binding sites could be found for VVA, LTA or UEA-I. Immunohistochemical studies used the Avidin-Biotin-peroxidase Complex (ABC) method for localization of S-100, FGF-1, FGF-2, ACE, GT, VEGF, ?-SMA, laminin, connexin 43, CD4, CD8 and CD68 in the epididymis. The epithelium of the efferent ductules showed intense immunoreaction for S-100, FGF-1 and FGF-2 and a moderate immunostaining for ACE and GT. Principal cells of the first three epididymal segments exhibited a distinct immunostaining for S-100. They also showed a distinct immunoreactivity for FGF-1 throughout the different segments. Principal cells in the first, second and sixth segment displayed intense immunostaining for ACE. Immunostaining for GT in Golgi zone of the principal cells was intense (segments II and III), distinct (segments IV and V) and moderate (segments I and VI). Basal cells showed moderate (FGF-1) or intense (FGF-2) immunostaining in different epididymal segments. Intense immunostaining for ACE, laminin and ?-SMA was found respectively in the endothelium, endothelial basal lamina and smooth muscle cells of blood vessels. The basal lamina of the epithelium and the peritubular smooth muscle cells displayed a moderate immunoreactivity for laminin. The peritubular smooth muscle cells manifested an intense immunostaining for ?-SMA. CD4+ T cells and CD68+ macrophages were found within the epithelium and in the interstitium. Mast cells were conventionally stained with Alcian blue and Toluidin blue. They also displayed a distinct immunostaining for VEGF and FGF-2. In conclusion, my study supports the previously proposed 6-segment scheme of bovine epididymis. Moreover, lectin histochemistry and immunohistochemistry were not only helpful tools in emphasising this scheme but also in correlating specific functional activities to certain regions. Lectins- and GT-binding sites as well as ultrastructural characteristics point to high synthetic and secretory activities of principal cells in the first three segments, as indicated by the well developed Golgi apparatus. Ultrastructurally, principal cells of the proximal three epididymal segments displayed a well developed endocytotic apparatus. This was reinforced by intense immunostaining for ACE in this region, which reflects extensive absorptive activities in this region. Existence of mast cells in the epididymal interstitium and T-lympho-cytes and macrophages in the interstitium and within the epithelium may reflect their harmonized co-operation in the induction of immune tolerance in the bovine epididymis.

In der vorliegenden Arbeit wurde die pränatale Entwicklung und Morphologie des bovinen Nabelstrangs untersucht. Hierfür wurde die Nabelschnur von Feten ab dem 2. Graviditätsmonat (SSL 2,5 cm) bis zum geburtsreifen Kalb im 9. Monat (SSL 89 cm) verwendet. Neben lichtmikroskopischen (routinehistologischen, immun- und glykohistochemischen) Färbungen wurden elektronenmikroskopische Techniken angewendet. Dabei besitzt die Nabelschnur des Rindes zu jedem Gestationszeitpunkt zwei Nabelvenen, zwei Nabelarterien und einen Urachus, die allesamt in der Wharton Sulze (WS) eingebettet sind. Bis zu einer SSL von 26 cm können in der Nabelschnur des Rindes das extraembryonale Nabelzölom und die Reste des Dottersackganges beobachtet werden. Die Nabelschnur wird außen ausschließlich vom Amnionepithel umgeben. Das Amnionepithel besteht aus ein- und mehrschichtigen Bereichen. Bei den mehrschichtigen Arealen handelt es sich meist um lokal begrenzte, glykogenreiche Amnionepithelwarzen (Plaques), die der Oberfläche einen zottenartigen Charakter verleihen. Ihre Anzahl steigt im Laufe der Entwicklung an. Ab einer SSL von 42 cm (6. Monat) scheinen die nun dicht stehenden Warzen zu fusionieren, so dass nun auch über größere Strecken mehrschichtige Amnionepithelbereiche auftreten. Im 7. Trächtigkeitsmonat (SSL 53 cm) beginnt das Amnionepithel stellenweise zu verhornen. Zahlreiche desmosomale Zellverbindungen und Interdigitationen der Plasmamembranen der Amnionepithelzellen sprechen für eine hohe mechanische Festigkeit des Amnionepithels. Die zum Teil erheblich erweiterten Interzellularräume zwischen den Epithelzellen sowie der hohe Mikrovillibesatz der apikalen Zellschichten deuten auf Sekretions- und Resorptionsprozesse hin. Im Gegensatz zu anderen Gefäßen besitzt die Nabelvene des Rindes eine gut ausgebildete Lamina elastica interna, wohingegen sie in der Nabelarterie fehlt. Die Muskelzellen der Nabelvene sind weit voneinander durch Bindegewebe getrennt, wodurch die Diffusion und der Transport von Nährstoffen erleichtert werden. Beide Gefäße besitzen Vasa vasorum und bestehen während der ganzen fetalen Entwicklung aus α-smooth-muscle-Aktin (αSMA) exprimierenden Muskelzellen. Die bovinen Nabelgefäße sind nicht innerviert. Dies wurde auch durch das Ergebnis der immunhistologischen Untersuchung des S100 Proteins bestätigt. Die Ultrastruktur der Endothel- und glatten Gefäßmuskelzellen der Nabelgefäße gibt Hinweise auf eine hohe Proteinsyntheseleistung sowie auf einen regen Stofftransport dieser Zellen. Die bovine WS wird von zahlreichen feinen Blutgefäßen durchzogen. Sie wird im Laufe der fetalen Entwicklung zell- und grundsubstanzärmer, jedoch faserreicher. Im Gegensatz zu der makroskopisch einheitlich erscheinenden WS, stellt sie sich bei mikroskopischer Betrachtung heterogen dar. Dabei lassen sich der Bereich um den Urachus, die schwach ausgebildete Adventitia sowie unter dem Amnionepithel befindliche WS-Bereiche von der restlichen zentralen WS abgrenzen. Der Eindruck der Heterogenität entsteht durch den unterschiedlichen Zellgehalt, durch die Ultrastruktur der Zellen, durch das Verteilungsmuster der Intermediärfilamente und des αSMA sowie durch das Lektinbindungsmuster und durch die Reaktionen in der Alcianblau-Färbung. Besonders auffällig ist die Entstehung einer breiten Schicht αSMA-exprimierender Muskelzellen in der WS subepithelial unter dem Amnionepithel, wobei ein sphinkterähnlicher Muskelring gebildet wird. Der Urachus weist zunächst ein einschichtiges Epithel auf, das im Laufe der Entwicklung jedoch mehrschichtig wird. Ab einer SSL von 26 cm (4. Trächtigkeitsmonat) wird er von zirkulär angeordneten Muskelzellen umgeben. Um das Vorkommen und die Verteilung bestimmter Zuckergruppen in der bovinen Nabelschnur zu bestimmen, wurde das Bindungsmuster verschiedener Lektine untersucht. Dabei konnte mit Con A, WGA, ECA, GSA I, PNA und VVA eine deutliche, mit SBA, UEA I und LTA jedoch nur eine schwache Reaktion hervorgerufen werden. Weiterhin ließ sich eine altersabhängige Expression der Intermediärfilamente Vimentin, Desmin und Pan-Cytokeratin (CK) beobachten. Dabei konnte der Epithelzellmarker CK in einigen Zellen der Nabelgefäßwand bis zum 2. Monat (6,5 cm SSL) und in einigen WS-Zellen bis zum 4. Monat (26 cm SSL) nachgewiesen werden. In den Gefäßmuskelzellen der bovinen Nabelgefäße werden im Laufe der Entwicklung alle drei Intermediärfilamenttypen exprimiert, während in den WS-Zellen, mit Ausnahme der glatten Muskelzellen des Urachus, Desmin immunhistologisch nicht nachweisbar ist. Da die bovinen Nabelgefäße nicht innerviert sind, muss der umbilikale Blutfluss durch andere, nicht-nervale Faktoren reguliert werden. Dabei sind unter anderem die Anordnung der Gefäßmuskelzellen sowie die Kontraktionsfähigkeit der Nabelgefäße, die sich in der frühen Expression von αSMA aller Gefäßmuskelzellen widerspiegelt, von Bedeutung. Die in den bovinen Nabelgefäßen typische Verteilung der elastischen Fasern spielt diesbezüglich ebenfalls eine wichtige Rolle. Zusätzlich ist der umbilikale Blutfluss von der Struktur und Konsistenz der WS abhängig. Die Zusammensetzung der WS wird dabei entscheidend durch die die extrazelluläre Matrix produzierenden WS-Fibrozyten beeinflusst. Eine aktive Beteiligung des sphinkterähnlichen Muskelrings an der Regulation des Blutflusses ist sehr wahrscheinlich. Einen weiteren Faktor der Blutflussregulation stellen vasoaktive Substanzen dar, wobei die Ultrastruktur der Endothel- und Gefäßmuskelzellen Hinweise auf eine mögliche lokale Produktion dieser Substanzen in den Nabelgefäßen gibt. Der Nachweis von bovinem Progesteron-Rezeptor (bPR) in den Endothelzellen der Nabelgefäße aller untersuchten Feten lässt eine Beteiligung von Progesteron an der umbilikalen Blutflussregulation vermuten.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu überprüfen, ob sich bei Hengsten durch die medikamentelle Beeinflussung des Stickstoffmonoxid-Systems die testikuläre Durchblutung und die Spermaqualität verbessern lassen. Außerdem sollte untersucht werden, ob sich hCG auf die Durchblutung des Hodens auswirkt und inwieweit dies mit den Änderungen der Sexualsteroidkonzentrationen im Blutplasma in Zusammenhang steht. Hierbei wurde zwischen fertilen und subfertilen Hengsten differenziert. Die Untersuchungen wurden an insgesamt 30 Warmbluthengsten durchgeführt. Im ersten Versuchsteil wurde jeweils 6 Hengsten das Ergänzungsfuttermittel FertilAid-for-Stallions (Fa. Total Health Enhancement Inc., USA) bzw. der Stickstoffmonoxid-Donor Molsidomin (Molsidomin retard-ratiopharm 8) über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal täglich oral verabreicht. Dabei bekamen die mit FertilAid-for-Stallions behandelten Hengste in den ersten beiden Wochen die doppelte Dosis (71g) und danach die einfache verabreicht. Sechs unbehandelte Hengste dienten als Kontrollgruppe. Molsidomin wurde in einer Dosierung von zweimal täglich 8 g appliziert. Vor und während der Behandlung wurde bei allen 18 Hengsten der Blutfluss der A. testicularis mit Hilfe der Dopplersonographie und die Spermaqualität mittels konventioneller Methoden und verschiedenen durchflusszytometrischen Assays ermittelt. In der zweiten Versuchsreihe bekamen acht Hengste, von denen 4 als fertil und 4 als subfertil klassifiziert wurden, 5000 IE hCG intravenös verabreicht (Ovogest5000, Fa. Intervet). Der testikuläre Blutfluss wurde zum Zeitpunkt 0 (= kurz vor hCG-Applikation) und 1, 3, 6, 12, 24, 72, 120 und 168 Stunden danach gemessen. Kurz vor jeder Untersuchung wurde den Hengsten eine Blutprobe aus der V. jugularis entnommen und später die Testosteron- und Östrogenkonzentrationen mit Hilfe eines EIA bestimmt. Den 4 Hengsten der Kontrollgruppe wurde nur das Lösungsmittel als Placebo intravenös appliziert. Die Durchblutung der A. testicularis wurde anhand des Blutflussvolumens (BFV) und des Pulsatility Index (PI) quantifiziert. Die Beurteilung der Spermaqualität erfolgte anhand des Ejakulatvolumens, der Spermiengesamtzahl, der Spermienmotilität, dem Anteil vitaler und akrosomgeschädigter bzw. –reagierter Spermien im SYTO17/FITC-PNA/PI-Assay und der Integrität der Chromatinstruktur im Spermachromatinstruktur-Assay (SCSA). Beim Vergleich der Blutflussparameter aller 30 Hengste vor Beginn der Behandlungen konnten hohe positive Korrelationen zwischen den Widerstandsindices RI und PI festgestellt werden (r = 0,91; p < 0,0001), wohingegen keine Zusammenhänge zwischen den beiden Widerstandsparametern und dem Blutflussvolumen bestanden (p > 0,05). Zwischen den Blutflussparametern und den verschiedenen Spermaparametern konnte vor der Behandlung nur eine Korrelation zwischen Blutflussvolumen und Spermiengesamtzahl (r = 0,65; p < 0,05) festgestellt werden. Während sich der testikuläre Blutfluss der Hengste der Kontroll- und Molsidomin-Gruppe im Untersuchungszeitraum nicht änderte, nahm das Blutflussvolumen der mit FertilAid-for-Stallions gefütterten Hengste kurzzeitig ab, während PI kontinuierlich abfiel (p < 0,05). Bei der Kontroll- und Molsidomin-Gruppe stieg der Anteil DNA geschädigter Spermien im Untersuchungszeitraum an, während bei der FertilAid-Gruppe ähnlich wie beim Blutflussvolumen ein kurzzeitiger Abfall und Wideranstieg auf das Ausgangsniveau zu verzeichnen war. Nach der Applikation von hCG stiegen die Testosteron- und Östrogenspiegel an. Die Testosteronwerte zeigten einen biphasischen Verlauf mit zwei Maxima, während die Östrogenwerte ihre maximalen Werte 6, 12 und 24 Stunden post applicationem hatten. Die Verabreichung von hCG bewirkte bei den Hengsten wellenförmige Veränderungen der Blutflussparameter, wobei BFV und PI gegensätzlich zueinander verliefen. Beim Vergleich der relativen Schwankungen der Blutflussparameter und der Sexualsteroidhormone fiel auf, dass die Schwankungen des Blutflussvolumens denen der Sexualsteroide ähnelten. So glichen besonders die Veränderungen und die Variationsbreite der Östrogenwerte denen des Blutflussvolumens, während die Schwankungen der Testosteronspiegel zeitversetzt waren. Subfertile Hengste unterschieden sich nach der hCG-Applikation von fertilen lediglich durch eine etwas geringere Zunahme des Blutflussvolumens und der Östrogenspiegel. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Behandlung mit dem Ergänzungsfuttermittel FertilAid-for-Stallions nur einen geringen Einfluss auf die testikuläre Durchblutung hatte und von den verschiedenen Spermaparametern nur die DNA-Integrität der Spermien verbessern konnte. Der NO-Donor Molsidomin hatte dagegen weder einen Einfluss auf die testikuläre Durchblutung noch auf die Spermaqualität. Die Verabreichung von hCG bewirkte einen Anstieg der testikulären Durchblutung, wobei diese Änderungen im Zusammenhang mit den Östrogenspiegeln im peripheren Blut standen. Es bestanden dabei aber nur geringe Unterschiede zwischen fertilen und subfertilen Hengsten.