Charakterisierung von HSS-2, einer B-zellspezifischen, regulatorischen DNA-Sequenz im Bereich des Ig(lambda)-Enhancers des Menschen
Beschreibung
vor 21 Jahren
Der menschliche Igl-Enhancer besteht aus den drei DNase
I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den
eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf
HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es,
die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu
charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und
In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die
Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60
und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit
Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder
mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der
Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige
Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die
Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von
Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des
Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird.
Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß
über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2
geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi
und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und
CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil
mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die
LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten
geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von
HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac
bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten
Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine
wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von
E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen
Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und
-differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor
für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in
Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich
durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.
I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den
eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf
HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es,
die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu
charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und
In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die
Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60
und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit
Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder
mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der
Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige
Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die
Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von
Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des
Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird.
Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß
über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2
geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi
und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und
CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil
mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die
LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten
geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von
HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac
bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten
Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine
wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von
E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen
Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und
-differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor
für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in
Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich
durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.
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