Optimierung eines Lipid-vermittelten Gentransfers für primäre, mesencephale Vorläuferneuronen in vitro

Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand in der Etablierung
einer dissoziierten Kultur mesencephaler Vorläuferzellen der Ratte
und deren nicht-virale Modifikation mittels kationischer Lipide. In
Vorversuchen wurden Faktoren zur Optimierung nicht-viraler
Transfektionsverfahren ermittelt. Zur Untersuchung des Einflusses
der Zellproliferation auf die Transfektionseffizienz, wurden LAN-5
Neuroblastomzellen in zwei Ansätzen mit unterschiedlichem
mitotischen Index mittels Effectene (Qiagen, Hilden) transfiziert.
Es konnte gezeigt werden, dass proliferierende LAN-5 Zellen fast
15-fach höhere Transfektionsraten bei der Transfektion mit
Effectene erzielen. In dem selben Versuchsansatz wurde die
Transfektionsrate des klonierten RSV-GFP, basierend auf dem
pRep7-Konstrukt, mit der des bereits bekannten CMV-GFP Plasmids
verglichen. Im Gegensatz zu den Erwartungen wurden mit dem
pRep7-Konstrukt deutlich niedrigere Effizienzen beobachtet. Das
VM-Gewebe wurde in dissoziierten in vitro Kulturen gemäß den
Protokollen von Studer und Kollegen (1998) kultiviert. Durch Gabe
von bFGF wurden die neuronalen Vorläuferzellen zunächst expandiert,
und erst durch Entzug von bFGF und Zugabe von fetalem Kälber Serum
setzte die Differenzierung ein. Dies konnte mit
immunhistochemischen Markern nachgewiesen werden. Da die Protokolle
zur Transfektion von organotypischen VM-Kulturen mit Effectene zu
toxisch für dissoziierte Vorläuferzellen waren, musste die
eingesetzte Menge an Effectene (Qiagen, Hilden) um das 10-fache
reduziert werden. Im Vergleich zu Effectene, erzielten die
getesteten Versuchslipide (Qiagen, Hilden) bis zu 31-mal höhere
Transfektionseffizienzen. Die immunhistochemische Charakterisierung
der transfizierten Zellen belegte die Transfektion TH-positiver
Neurone. Durch die vorgelegte Arbeit konnten Methoden zur
genetischen Modifikation primären mesencephalen Gewebes etabliert
werden, die auf chemisch genau definierten Lipid-Komponenten
beruhen und die nicht mit den Risiken viraler Vektorsysteme
behaftet sind. Durch den effizienten Einsatz Lipid-vermittelten
Gentransfers entstehen damit neue Perspektiven für einen möglichen
Einsatz nicht-viraler Transfektionsverfahren in ex vivo
Gentherapie-Ansätzen.