Der Rho-GTPase Effektor WAVE1 im endosomal-lysosomalen Pathway in primären Makrophagen

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen
Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer
Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie
Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender
Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren
Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören
die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei
WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels
eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären
Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine
Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch
bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit
der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in
Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen
WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen
gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert.
Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses
Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung
der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an
Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen
sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose
befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten,
wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch
WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die
Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt,
wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden
von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den
aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten
wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von
WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den
entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die
phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen
entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus
der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog.
fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet.
Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit
fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln
kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die
kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im
endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend,
zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte
Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende
Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen
des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der
Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die
WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und
Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich
dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts
als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die
Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des
Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit
konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von
Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie
erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels
Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport
der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden.
WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der
einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und
Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von
WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen
Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der
WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der
zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel
überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu
einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln.
Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine
essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch
Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen
Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach
Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten
in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine
gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass
PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere
Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf
einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor
allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die
Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog.
mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al.,
1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der
vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch
Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl
auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der
Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die
MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der
Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein
hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden:
Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac.
Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen
wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses
seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an
der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch
einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von
Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und
beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1
erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel
kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den
internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich
Lysosomen zur Degradierung zugeführt.