Untersuchungen zur Wechselbeziehung von Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fragen zur Wechselbeziehung von
Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am
PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae bearbeitet. Im ersten
Teil der Arbeit wurden zwei Deletionsmutanten des
Transkriptionsfaktors Pho4 hergestellt und charakterisiert. Dazu
wurden aus der PHO4-Sequenz mit Hilfe einer PCR-gestützten Methode
jeweils die für die Aminosäuren 97 bis 106 sowie 101 bis 110
kodierenden Sequenzen entfernt. Mit Hilfe von geeigneten
Expressionsvektoren wurden beide Deletionsmutanten in S. cerevisiae
exprimiert. Das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung durch die
Konstrukte wurde durch Messung der Aktivität der saueren
Phosphatase bestimmt. Beide Mutanten bewirkten eine deutliche
Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor. Daraus kann
geschlossen werden, dass die hier deletierten Abschnitte von PHO4
keinen wesentlichen Anteil an der Transkriptionsaktivierung durch
Pho4 haben. Zwischenzeitlich wurde der Nachweis einer minimalen
transkriptionsaktivierenden Domäne von Pho4 publiziert. Die
minimale transaktivierende Domäne besteht aus den Aminosäuren 79
bis 99. Dieser Abschnitt ist notwendig und ausreichend für die
Öffnung der Chromatinstruktur des Promotors und die Aktivierung der
Transkription. Die hier beschriebene Herstellung und
Charakterisierung der Deletionsmutanten von PHO4 leistete einen
wesentlichen Beitrag zur Eingrenzung der transaktivierenden Domäne
von Pho4. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Wirkung
des als GAGA-Faktor (GAF) bezeichneten Transkriptionsfaktors aus
Drosophila melanogaster am PHO5-Promotor von S. cerevisiae. Dazu
wurden chimäre Konstrukte aus dem GAF und der DNA-bindende Domäne
des Transkriptionsaktivators Pho4 hergestellt. Zudem wurden auch
Fusionskonstrukte mit jeweils nur einer Hälfte des GAF und der
DNA-bindende Domäne des Pho4 erzeugt. Diese Konstrukte wurden in S.
cerevisiae exprimiert. Hier zeigte sich, dass die Verbindung aus
dem gesamten GAF und der DNA-bindenden Domäne von Pho4, vermutlich
aufgrund eines gestörten intrazellulären Transports oder aufgrund
einer Instabilität des Proteins, keine Aktivität aufwies. Dagegen
waren die Konstrukte, welche jeweils nur eine Hälfte des GAF
enthielten, in der Lage, eine Öffnung der Chromatinstruktur und
eine Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor zu bewirken.Um
zu untersuchen, welche Veränderungen die chimären Konstrukte durch
ihr Angreifen am PHO5-Promotor an der Chromatinstruktur des
Promotors verursachen, wurden spezielle experimentelle Verfahren
angewendet. Diese nutzen die unterschiedliche Zugänglichkeit der
DNA für Enzyme bei geöffneter oder geschlossener Chromatinstruktur.
Die Untersuchungen zeigten eine gleichartige Öffnung der
Chromatinstruktur am PHO5-Promotor durch beide Konstrukte. Die
gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur korrelierte dabei nicht
mit dem unterschiedlichen Umfang der Transkriptionsaktivierung von
PHO5. Aufgrund der fehlenden Korrelation von Chromatinöffnung und
Transkriptionsaktivierung stehen diese Ergebnisse im deutlichen
Widerspruch zu der von vielen Autoren vertretenen Hypothese, der
GAF würde die Transkription indirekt, nur durch die Öffnung
repressiver Chromatinstrukturen aktivieren (Derepression). Vielmehr
weisen diese Ergebnisse darauf hin, das der GAF auch als
klassischer Transaktivator eine direkte Aktivierung der
Transkription bewirken kann. Die Aktivierung der Transkription
durch beide Hälften des GAF in den chimären Konstrukten war ein
überraschendes Ergebnis. Es zeigt, dass GAF neben der
glutaminreichen Domäne eine weitere Domäne enthält, die in vivo
eine Aktivierung der Transkription bewirken kann. Diese Erkenntnis
ist grundsätzlich neu und in der Literatur bisher nicht beschrieben
worden.