Klonierung, Expression und funktionelle Analyse von Hühner-Interleukin-12

IL-12, ein heterodimeres Zytokin bestehend aus IL-12p40 und
IL-12p35, wird hauptsächlich von Zellen des angeborenen
Immunsystems als Antwort auf intrazelluläre Pathogene gebildet und
induziert eine TH1 vermittelte Immun- reaktion. Hühner IL-12p40
wurde in einer EST-Datenbank identifziert und vollständig kloniert.
Der Vergleich des Hühner IL-12p40 Gens mit verschiedenen
Säugerhomologen ergab Aminosäureidentitäten von 39,7% bis 43,5%. In
der Hühnergenomsequenz wurde das IL-12p40 Gen auf Chromosom 13
lokalisiert, es ist 4898bp lang und besteht aus fünf Exons und vier
Introns. Der korrespondierende offene Leserahmen besteht aus 945bp
und kodiert für ein 315 Aminosäuren langes Protein. ChIL-12p40
wurde sowohl in prokaryotischen als auch in einem eukaryotischen
System exprimiert und unter denaturierenden bzw. nativen
Bedingungen aufgereinigt. Mit Hilfe des aus E. coli gewonnen
ChIL-12p40 wurde ein polyklonales Kaninchen-a-ChIL-12p40 Antiserum
entwickelt, das sowohl ChIL-12p40 aus prokaryotischem
Expressionssystem als auch aus dem eukaryotischen Schneider
SL-3-System erkennt und im Westernblot ChIL-12p40-Mengen bis zu
7,5ng detektiert. Die Klonierung der Hühner IL-12p35 Kette mit
Hilfe von PCR mit Oligonukleotiden, spezifsch für hochkonservierte
Regionen in Säugerhomologen, war nicht erfolgreich. Erst nach der
Veröffentlichung der Hühnergenomsequenz konnte das Hühner IL-12p35
Gen auf Chromosom 9 identifziert wer- den. Die genomische Sequenz
ist 1797bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die
kodierende Region ist 615bp lang und kodiert für ein 205
Aminosäuren langes Protein, das 26,8% bis 31,2% Identität zum
Säuger aufweist. Die Gene für Hühner IL-12p40 und IL-12p35 wurden
durch einen Linker hintereinander kloniert und als IL-12p40/p35
-"Flexi-IL-12" exprimiert. Zur Analyse der Expression von IL-12p40
wurde RT-PCR auf cDNA Proben durchgeführt, die von verschiedenen
Zelllinien, Geweben sowie stimulierten und unstimulierten Zellen
stammten. IL-12p40 Signale wurden in HD-11-, RP9-, 2D8-, T16G5-,
JJ1G9-, OU2-, CEC32-Zellen und mit IL-2 stimulierten Milzleukozyten
detektiert. Zur weiteren Kontrolle wurde auch IFNg und IL-18 per
PCR nachgewiesen. In einem in vitro Zellsystem wurde nachgewiesen,
dass das rekombinant hergestellte Hühner IL-12p40
konzentrationsabhängig Milzzellen zur Sekretion von IFNg
stimuliert.