Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum Nachweis des Krebspesterregers Aphanomyces astaci SCHIKORA (Oomycota) aus Krebsgewebe (Astacus astacus)

Im Literaturüberblick der vorliegenden Arbeit wird besonders auf
die ökonomische und ökologische Bedeutung der Flusskrebse, den
derzeitigen Stand der Forschung die Krebspest betreffend und die
aktuelle taxonomische Klassifikation des Krebspesterregers,
Aphanomyces astaci, eingegangen. Ziel der vorliegenden Arbeit war
es, eine zuverlässige und schnelle Methode zum spezifischen und
sensitiven Nachweis von Aphanomyces astaci direkt aus Krebsgewebe
zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein kommerzielles
Fertigkit (DNeasy Tissue Kit, Qiagen) als geeignete
DNA-Extraktionsmethode ausgewählt. Als Untersuchungsmaterial wurde
die Abdominalkutikula von Edelkrebsen (Astacus astacus) eingesetzt.
Anhand von Genomanalysen der ITS-Regionen (Genabschnitte, die
zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen)
verschiedener Oomycota wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert,
optimiert und auf ihre Eignung überprüft. Ausgehend von diesen
Untersuchungen wurden zwei PCR-Protokolle etabliert: eine
Semi-Nested und eine Nested PCR. Die Semi-Nested PCR, die sich für
die Routinediagnostik von Aphanomyces astaci als wenig geeignet
erwiesen hat, bietet das Potential, als Grundlage für
weiterführende Studien an anderen Arten der Gattung Aphanomyces zu
dienen. Die Nested PCR mit den äußeren Primern NS 166/NS 681 und
den inneren Primern BO 525/BO 640 ergab mit allen 20 untersuchten
Aphanomyces astaci-Stämmen ein PCR-Produkt von etwa 115 bp, das mit
einer anschließenden Restriktionsenzym-Analyse mit der Endonuklease
Hph I verifiziert werden konnte. Die Nested PCR zeigte sich
hochspezifisch gegenüber Aphanomyces astaci, während die DNA von
anderen bei Krebsen und im Wasser vorkommenden Krankheitserregern
und die DNA von Wirtsgewebe nicht amplifiziert wurde, was
Grundvoraussetzung für den Einsatz dieser PCR als Standardmethode
ist. Die Nachweisgrenze der Nested PCR lag bei Verwendung von
Plasmid-DNA bei 1,9 genomischen Einheiten und bei Einsatz von
genomischer DNA aus Pilzmyzel bei 1 ag. Als Zusammenfassung 172
Aphanomyces astaci-Sporen in die DNA-Extraktion eingesetzt wurden,
lag die Nachweisgrenze bei 1 Spore. Zusätzlich wurden
Infektionsversuche durchgeführt, bei denen Edelkrebse mit 10, 100
und 1000 Aphanomyces astaci-Zoosporen/ml infiziert wurden. Ein
positives PCR-Ergebnis konnte ab Tag 2 post expositionem
(entspricht dem Tag der ersten Probenentnahme) mit der
beschriebenen Methode bei allen untersuchten Tieren beobachtet
werden. Schließlich wurde eine Validierung der entwickelten Nested
PCR unter Einsatz von Wirtskutikula anhand 19 diagnostischer Proben
unterschiedlicher Herkunft innerhalb Europas (aus Deutschland, der
Schweiz, Österreich, Schweden und England) durchgeführt und die
Ergebnisse mittels RFLP verifiziert. Mit der in der vorliegenden
Arbeit entwickelten molekularbiologischen Nachweismethode steht ein
Verfahren zur Verfügung, das eine zuverlässige Diagnose von
Aphanomyces astaci bereits im Anfangsstadium der Infektion direkt
aus Krebsgewebe ermöglicht und innerhalb von 12 bis 15 Stunden
(Sektion, DNA-Extraktion, Nested PCR, Agarosegel-Elektrophorese und
bestätigende Restriktionsenzym-Analyse) durchführbar ist. Diese
Methode ist somit ein geeignetes und zuverlässiges Mittel, um in
Programmen zur Seuchenbekämpfung der Krebspest (Aphanomyces astaci)
eingesetzt zu werden.