Funktion der Kanalproteine TRPC1 und TRPC6 in embryonalen Fibroblasten und Podozyten der Maus

TRPC-Kanäle 1-7 wurden bisher als unselektive Kationenkanäle in
heterologen Expressionssystemen beschrieben. Ihre physiologische
und pathophysiologische Rolle in verschiedenen Organen und Geweben
des menschlichen Körpers ist aber noch weitgehend unklar. Ziel
dieser Arbeit war es, die Funktion zweier Mitglieder der
TRPC-Familie, TRPC1 und TRPC6, in verschiedenen Zellsystemen mit
Hilfe von Untersuchungen an den entsprechenden gendefizienten
Mausmodellen näher zu analysieren. Nach der Klonierung der
codierenden Sequenz des murinen TRPC1-Proteins aus Mausgeweben,
wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) aus TRPC1-defizienten
und Wildtyp-Mäusen isoliert. Ein Vergleich zeigte, dass das Fehlen
des TRPC1-Kanals die Viabilität dieser Zellen signifikant steigerte
und die Wundheilungsrate signifikant herabsetzte. Durch die
Identifikation sogenannter überaktivierter TRPC6-Kanal-Mutanten in
Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) war dann
insbesondere die Funktion dieses Kanals in den Podozyten der Niere
von besonderem Interesse. Wenig später wurden auch funktionslose
Mutanten der Phospholipase C-e (PLCe) in Patienten mit dem gleichen
oder einem ähnlichen Krankheitsbild beschrieben, das zu einer
Erhöhung des Serumproteingehalts im Urin (Proteinurie) führt. Zur
Beantwortung der Frage, ob beide Proteine interagieren und
Komponenten eines gemeinsamen Signalweges sind, wurden primäre
Podozyten aus Mäusen isoliert. In der Tat wurde in primären
Podozyten und in HEK293-Zellen eine Interaktion beider Proteine
identifiziert und ein möglicher Signalweg von der Aktivierung des
Angiotensin 1-Rezeptors zum PLCe-induzierten Calciumioneneinstrom
durch TRPC6-Kanäle aufgezeigt. Darüber hinaus wurden TRPC6-, PLCe-
und TRPC6/PLCe-defiziente Podozyten mit Wildtyp-Podozyten in
funktionellen Testsystemen verglichen. Zunächst konnte eine
vermehrte Expression von TRPC4- und TRPC5-Kanälen in
PLCe-defizienten und TRPC6/PLCe-defizienten Podozyten identifiziert
werden. Außerdem zeigte sich in ersten Untersuchungen, dass das
Fehlen des TRPC6-Kanals zu einer erhöhten Zellviabilität und zu
einer verminderten Apoptoserate der Podozyten führte. In sog.
Calcium-Imaging-Experimenten wurde ein stark reduzierter
Calciumioneneinstrom in TRPC6- und PLCe-defizienten Podozyten nach
AT1-Rezeptoraktivierung durch Angiotensin II beobachtet. Da
Podozyten durch ihre Barrierefunktion wesentlich zur Stabilität des
glomerulären Filters beitragen, wurde auch die Veränderung des
Zytoskeletts durch Aktinpolymerisation näher untersucht. Es zeigte
sich, dass Podozyten nach Applikation von Angiotensin II durch eine
stärkere Polymerisation von globulärem Aktin vermehrt sog.
Aktin-Stressfibern ausbilden und abflachen. TRPC6-defiziente
Podozyten hingegen zeigen bereits im Ruhezustand deutlich mehr
Aktin-Stressfibern, die nach Gabe von Angiotensin II nicht mehr
signifikant in ihrer Anzahl zunehmen. Die Daten der vorliegenden
Arbeit sind im Einklang mit der Hypothese, dass ein zu starker
Calciumioneneinstrom in Podozyten durch überaktivierende
TRPC6-Mutationen zu einer geringeren Podozytenstabilität und zu
einer erhöhten Apoptoserate führen kann. Die mangelnde Stabilität
des glomerulären Filters in den FSGS-Patienten führt dann zu einer
Proteinurie und schließlich zum Nierenversagen. Durch Expression
der TRPC6-Mutationen in TRPC6-defizienten Podozyten könnte sich in
Zukunft die Rolle des Kanals als wichtige pharmakologische
Zielsubstanz für eine Pharmakotherapie der FSGS bestätigen.