Development, establishment and implementation of molecular biological methods for the detection of enterotoxinogenic Bacillus cereus

Bacillus cereus ist als Sporenbildner mit ubiquitärem Vorkommen
sowie ausgeprägten lipo- und proteolytischen Eigenschaften ein
Problemkeim in der Lebensmitteltechnologie und -hygiene und
verursacht Lebensmittelintoxikationen und -infektionen, die zu den
wichtigsten lebensmittelassoziierten Krankheiten gezählt werden.
Derzeit besteht in der Routinediagnostik ein Mangel an schnellen
und zuverlässigen Methoden zur simultanen Detektion der für diese
Erkrankungen kausalen B. cereus Toxine bzw. der zugrunde liegenden
Toxin-Gene hbl, nhe, ces und cytK1. Im Rahmen dieser Studie wurden
deshalb konventionelle und real-time multiplex PCRs zum simultanen
Nachweis der B. cereus Toxin-Gene (hbl, nhe, ces und cytK1)
entwickelt und an zuvor bereits immunologisch, zell- und
molekularbiologisch charakterisierten B. cereus Stämmen (n = 146)
der Stammsammlung des Instituts etabliert: Zur Anwendung in
konventionellen Systemen konnten vier multiplex PCRs (PCR 1 – 4)
realisiert werden, wobei PCR 1 und 2 dem gleichzeitigen Nachweis
der Gene hblC, nheA, ces (PCR1) bzw. hblC, nheA, ces und cytK1 (PCR
2) dienen und mit PCR 3 und 4 die spezifische Detektion der Gene
hblC, hblD und hblA bzw. nheA, nheB und nheC ermöglicht wird.
Sowohl in den beiden Screening PCRs als auch in den PCRs zur
Feindifferenzierung wurde eine Interne Amplifikationskontrolle
(IAC) eingesetzt. Für die Applikation in real-time Systemen wurde
eine auf SYBR Green I basierende multiplex PCR zur Detektion der B.
cereus Toxin-Gene hblD, nheA, ces und cytK1 entwickelt und
erfolgreich in den Cyclern LC 2.0 und LC 480 eingesetzt. Die
Schwellenwert-Zyklen der multiplex Reaktionen stimmten gut mit
denen der singleplex Assays überein und es konnte kein relevanter
Sensitivitätsverlust festgestellt werden. In beiden Cyclern wurden
für die vier Amplifikate signifikante Unterschiede der
Schmelztemperaturen berechnet (p < 0,001). Anschließend wurden
die multiplex PCRs zur Charakterisierung von Bacillus cereus
Isolaten (n = 208) aus Lebensmittel- und Hygienestatuskontrollen
der Bundeswehr eingesetzt. Anhand der detektierten Toxin-Gene
konnten die B. cereus Isolate in drei Profile eingeteilt werden
(nhe + hbl; nhe + ces; nhe) mit Prävalenzen von 99,5 % für nhe,
62,9 % für hbl sowie 4,3 % für ces. In einem zweiten Schritt wurden
die B. cereus Isolate mit validierten, auf monoklonalen Antikörpern
basierenden Enzymimmuntests und Zytotoxizitätstests untersucht,
wobei eine hohe Übereinstimmung der mit den drei unabhängigen
Methoden (PCR, EIA, Zelltest) erhaltenen Ergebnisse verzeichnet
wurde. Im Vergleich zu früheren Studien konnte somit eine deutliche
Verbesserung der Zuverlässigkeit der molekularbiologischen
Ergebnisse erreicht werden.