Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07 Archiv

The incretin hormones GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) mediate the so-called incretin effect, which describes the phenomenon that glucose given orally causes a higher insulin response compared to an isoglycemic intravenous glucose load. The insulinotropic action of GIP is reduced to almost absent in type 2 diabetes patients, while the action of GLP-1 is vastly preserved. GIPRdn transgenic pigs were generated by lentiviral genetransfer to establish a large animal model to investigate the effects of an impaired insulinotropic action of GIP on glucose homeostasis. At the age of 5 months GIPRdn transgenic pigs showed a disturbed oral glucose tolerance going along with reduced insulin secretion. Eleven-month-old GIPRdn transgenic pigs exhibited an impaired intravenous glucose tolerance and reduced insulin secretion as well as a significantly reduced total β-cell volume compared to controls. In this work different age classes (11 weeks, 5 months, 1-1.4 years) of GIPRdn transgenic were investigated to obtain detailed data about physiological and morphological characteristics. To proof specifity of the GIPRdn GIP/Exendin 4 stimulation tests were carried out in 11 week-old GIPRdn transgenic pigs. The insulinotropic action of intravenously injected porcine GIP was impaired, while this of Exendin-4, a GLP-1 mimetic, was enhanced in GIPRdn transgenic pigs compared to controls. Marked alterations in the expression profile of the GIPR and the GLP-1R were excluded as no apparent differences of immunohistochemically stained pancreas sections for GIPR and GLP-1R were detectable between GIPRdn transgenic pigs and controls at any age group. The effects of the impaired insulinotropic action of GIP on glucose metabolism were investigated by oral and intravenous glucose tolerance tests. Eleven-week-old GIPRdn transgenic pigs exhibited significantly reduced oral glucose tolerance with a delay in insulin secretion compared to controls. The area under the insulin curve (AUC insulin) during the first 45 minutes following glucose load was 31% smaller in transgenic pigs compared to controls. The total amount of insulin secretion was not different between the two groups indicating that GIPRdn expression initially only interferes with the incretin effect. This was supported by the fact that intravenous glucose tolerance and insulin secretion in transgenic pigs were not different from controls. Five-month-old GIPRdn transgenic pigs exhibited a tendency towards reduced intravenous glucose tolerance and reduced insulin secretion in response to an intravenous glucose challenge. To determine the reason for the alterations in glucose metabolism quantitative stereological analyses of the pancreas were performed. In 11-week-old pigs, transgenic and control groups showed similar β-cell mass. However, pancreatic -cell mass was reduced by almost 40% in 5-month-old and by 60% in adult (1 1.4 years) GIPRdn transgenic pigs compared to controls. Furthermore, the cellular composition of the islets was analyzed by quantitative stereological investigations. The relative volumes of α- and -cells in the islets were increased in 1-1.4-year-old GIPRdn transgenic pigs but the absolute volumes of these non-β-cell populations were not different from those of age-matched controls. To investigate the reason for the reduced pancreatic β-cell mass in GIPRdn transgenic pigs, β-cell proliferation and apoptosis rate was determined performing a double-immunohistochemistry for insulin and the proliferation marker Ki67 and cleaved caspase-3, respectively. Eleven-week-old GIPRdn transgenic pigs showed significantly less Ki67 positive cell nuclei compared to controls, whereas proliferation rates in 5 month-old and 1-1.4-year-old GIPRdn transgenic pigs reached no statistical significance. No differences were shown in the apoptosis rates of GIPRdn transgenic pigs compared to controls at any age, although a trend of higher numbers of cleaved caspase-3 positive β-cells was visible in 1-1.4-year-old GIPRdn transgenic pigs. In conclusion, GIPRdn transgenic pigs exhibit a comparable situation as in type 2 diabetes mellitus patients like impaired insulinotropic action of GIP, disturbed glucose tolerance and reduced β-cell mass. Moreover, the results of this work demonstrate an essential role of GIP for the physiological expansion of β-cell mass. In this context GIPRdn transgenic pigs represent a valuable model for further investigations on type 2 diabetes mellitus including diet studies and therapeutic trials.

Influenza A virus infections are a major threat to the world poultry population. In the 19th century fatal influenza A virus infections have been described under the name “fowl plague” in chickens. The chicken is a natural host for this viral infection. The myxovirus resistance (Mx) gene which belongs to the group of interferon stimulated genes (ISG) was first described in mice. This protein confers protection against highly pathogenic influenza A viruses in mice. Mx proteins have been characterized in many species including mammals, poultry and fish. They belong to the family of large GTPase proteins exhibiting three highly conserved GTP-binding motifs at the amino-terminus and a leucin zipper at the carboxy-terminus. The GTPase activity was been shown to be essential for the antiviral activity of the Mx protein. Mx was also identified in the chicken, where it shows a significant degree of polymorphism. A polymorphism at aminoacid position 631 (serin versus asparagin) is thought to confer antiviral activity towards influenza A viruses. With the help of the RCAS retroviral vector system these two different chMx isoforms were examined in vitro and in vivo for their antiviral activity towards various pathogenic influenza A viruses. Neither in vitro nor in vivo antiviral activity of the chMx isoforms was detectable. In contrast overexpression of murine Mx1 and human MxA in the same form led to protection of the chicken embryo fibroblast cultures against influenza A viruses. Stimulation of chicken embryo fibroblasts with type I interferon induced chMx mRNA and protein expression as well as an antiviral state of the cells. However a chMx knock down mediated by siRNA did not lead to the loss of the antiviral state mediated by type I interferon. In summary, the in vitro studies did not provide evidence for a role of chMx in the antiviral state induced by type I interferon.

Das Ovine Herpesvirus-2 (OvHV-2) ist der Erreger des Schaf-assoziierten Bösartigen Katarrhalfiebers (SA-BKF), einer meist tödlich verlaufenden, lymphoproliferativen Erkrankung, die weltweit bei Rindern und anderen Ungulaten vorkommt. Die meisten der in Bayern beobachteten Fälle von SA-BKF bei Rindern sind auf eine gemeinsame Haltung mit Schafen zurückzuführen, die das Virusreservoir des OvHV-2 darstellen. Wie stark die Virusinfektion in bayerischen Schafherden verbreitet ist, konnte bisher nur vermutet werden. Für Rinder fehlten fundierte Daten über die Häufigkeit und Bedeutung möglicher subklinischer Infektionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in 20 bayerischen Mischbetrieben die jeweiligen Prävalenzen von OvHV-2-Infektionen im Schaf- und Rinderbestand mittels eines kompetitiven ELISA und einer seminested PCR ermittelt und umfassende anamnestische Daten zu den Betrieben erhoben. Es wurden zwei Studiengruppen zu je zehn Betrieben mit und entsprechend ohne klinische, virologisch bestätigte BKF-Fälle bei Rindern zwischen Januar 2007 und Dezember 2009 gebildet. Alle untersuchten Schafherden waren zu einem großen Anteil OvHV-2-infiziert. In Betrieben der Gruppe 1, in denen klinische Fälle von BKF bei Rindern auftraten, lag die mediane Seroprävalenz BKF-Virus-spezifischer Antikörper der einzelnen Schafherden bei 100 % und die Prävalenz der mittels Genomnachweis festgestellten OvHV-2-Infektionen betrug 92 %. In den Schafherden der Gruppe 2 wurden dagegen nur eine Seroprävalenz von 73 % und eine OvHV-2-Genom-Prävalenz von 58 % festgestellt. Ebenso ergaben die Untersuchungen der Rinder einen klaren Unterschied zwischen den beiden Studiengruppen. In Betrieben der Gruppe 1 lagen die Seroprävalenzen bei 24 % und ausschließlich in Betrieben dieser Gruppe war bei 13 Rindern OvHV-2-DNA im Blut nachweisbar. Die Rinderbestände der Gruppe 2 waren nur zu 16 % seropositiv für BKF-Erreger-spezifische Antikörper und das Blut keines der Tiere reagierte in der PCR. Dass vor allem in den untersuchten Mischbetrieben, in denen ein besonders enger und auch direkter Kontakt zwischen Schafen und Rindern bestand, sowohl die Seroprävalenzen bei den Rindern, als auch die Anzahl der Rinder mit nachweisbarer OvHV-2-DNA im Blut relativ hoch waren, lässt auf einen ursächlichen Zusammenhang schließen. Außerdem traten in diesen Mischbetrieben, die zudem sehr hohe OvHV-2-Prävalenzen in den Schafherden hatten, auch subklinische OvHV-2-Infektionen bei elf Rindern auf. Diese Tiere zeigten bei wiederholter Untersuchung auch bis zu eineinhalb Jahren nach initialer Diagnose keine mit BKF assoziierbaren klinischen Symptome. Der auf die Zellzahl normierte Gehalt an OvHV-2-Genomkopien in den Blutproben dieser Rinder, wie interessanterweise auch der Schafe, lag in einem Bereich von 1,7 x 10-4 bis 1,7 x 10-1 OvHV-2-Genomkopien. In Blutproben von Rindern mit klinischem BKF dagegen lag der relative OvHV-2-Genomgehalt deutlich höher. In den Organproben eines akut an BKF erkrankten Rindes schließlich wurde der höchste relative OvHV-2-Genomgehalt in den Lymphknoten und der Milz nachgewiesen. Der relative OvHV-2-Genomgehalt von in vitro kultivierten, mit Con A stimulierbaren Lymphozyten eines subklinisch infizierten Rindes stieg im Laufe von zehn Wochen deutlich an, fiel jedoch nach einem Peak bei 8,4 x 102 wieder ab. Durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen liegen erstmals Prävalenzdaten zu OvHV-2-Infektionen in selektierten bayerischen Rinder- und Schafherden vor. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten untersuchten Schafe tatsächlich mit OvHV-2 infiziert sind und dass subklinische OvHV-2-Infektionen des Rindes in Bayern durchaus vorkommen. Da über diese Form der Infektion bei Rindern noch wenig bekannt ist und generell das Vorkommen der OvHV-2-Infektionen in Bayern unterschätzt wird, besteht ein weiterer Forschungs- und Aufklärungsbedarf.

Ziel dieser Studie war es, die Zusammenhänge zwischen Schilddrüsenparametern und Verhaltensproblemen oder Verhaltensstörungen bei Hunden zu untersuchen. Von Ende Juni 2008 bis Anfang Juli 2009 wurden 216 Hunde-Serumproben von 23 kooperierenden verhaltenstherapeutisch tätigen Tierärzte/innen deutschlandweit eingesandt und am Lehrstuhl für Tierschutz, Verhaltenskunde, Tierhygiene und Tierhaltung des Veterinärwissenschaftlichen Departments der Tierärztlichen Fakultät München (Ludwig-Maximilians-Universität) analysiert. Es wurden die Parameter T4, fT4, T3, fT3, TSH und Cholesterol ausgewertet. Neben den Verhaltensproblemen und Verhaltensstörungen wurden Daten zu Rasse, Größe, Alter, Geschlecht, Kastration, Zyklusstand, Jahreszeit, Impfstatus, Erkrankungen, Medikation mit Bezug auf die Schilddrüsenparameter und den Cholesterol-Wert ausgewertet. Das Problemverhalten und die Verhaltensstörungen wurden für die Analysen kategorisiert. Da jeder Hund mehrere Verhaltensprobleme und/oder Verhaltensstörungen aufweisen kann, konnten sie in mehreren Verhaltenskategorien vertreten sein. Da bislang keine gesicherten Daten zu Hunden ohne Verhaltensproblemen und/oder Verhaltensstörungen mit Bezug auf die Schilddrüsenparameter und Cholesterol-Werte vorliegen, wurden die Hunde ohne das jeweilige Verhaltensproblem und/oder die Verhaltensstörung als Referenzgruppe verwendet. Die Beurteilung der Schilddrüsenparameter und des Cholesterol-Wertes erfolgte anhand von vorhandenen Referenzwerten. Dabei wurden die Schilddrüsenparameter T4, fT4, T3, fT3, und TSH ebenfalls mittels Chemilumineszenzimmunoassay und die Cholesterol-Werte mittels klinisch-chemischem Verfahren analysiert. Die durchschnittlichen Parameter aller analysierten Proben lagen für die Schilddrüsenparameter mit Ausnahme von fT4 im unteren Bereich der Referenzwerte. Im Vergleich der Rassen (FCI Gruppen) zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den T4-, fT4-, T3-, fT3- und TSH-Werten. In Bezug auf die Größe konnten signifikant höhere T4-, fT4-, T3-Werte bei kleinen Rassen ermittelt werden. Der Unterschied beim fT3-Wert war nicht signifikant, zeigte aber dieselbe Tendenz. Beim Alter zeigten sich signifikante Unterschiede beim T3- und TSH-Wert. Der T3-Wert war in der Altersgruppe ≤ 12 Monate höher als der Wert in der Altersgruppe 13 Monate bis 8 Jahre. Der TSH-Wert stieg mit höherem Alter in allen Altersgruppen signifikant an, welches im Einklang mit den in der Literatur beschriebenen Veränderungen steht. Der Vergleich der Schilddrüsenparameter und des Cholesterol-Wertes in Bezug auf das Geschlecht ergab höhere fT4-, und Cholesterol-Werte sowie einen niedrigeren TSH-Wert bei Hündinnen. Bei kastrierten Hündinnen zeigten sich signifikant niedrigere T4- und T3-Werte im Vergleich zu den unkastrierten. Die verschiedenen Zyklusstände der Hündinnen ergaben keine Unterschiede. Des Weiteren wurden die Auswirkungen der jahreszeitlichen Bedingungen untersucht. Im Verlauf des 2., 3. und 4. Quartals zeigten sich ansteigende T3-Werte. Der TSH-Wert hingegen war im 1. Quartal höher als im 4. Quartal. Weiterhin hatten die Tiere, die in den letzten 3 Monaten geimpft wurden, einen signifikant höheren T4-Wert als die Hunde, die nicht, oder vor über 3 Monaten, ihre Impfung bekamen. Unterschiede zwischen den Parametern in Bezug auf die Erkrankungen konnten nicht festgestellt werden. Jedoch wurden bei Hunden mit Medikamentengaben innerhalb der letzten 3 Monate (außer Wurmkuren) signifikant höhere TSH-Werte festgestellt. Der Vergleich der verschiedenen Verhaltensprobleme und Verhaltensstörungen in Bezug auf die einzelnen Schilddrüsenparameter und das Cholesterol ergaben folgende Ergebnisse: Hunde der Verhaltenskategorie Angst und aggressives Verhalten wiesen signifikant niedrigere fT3- und Cholesterol-Werte auf als die Referenzgruppe. Hunde mit Angst vor Artgenossen hingegen hatten signifikant höhere T4-Werte als die Referenzgruppe. Diese Tendenz war ebenso bei den Hunden mit Trennungsangst ersichtlich, jedoch nicht signifikant. Hunde mit Trennungsangst hingegen wiesen einen signifikant niedrigeren TSH-Wert auf als die Referenzgruppe. Bei Hunden mit emotionalen Störungen / Gehirnfunktionsstörungen konnten signifikant niedrigere T3-Werte ermittelt werden. Im Gegensatz dazu wurde bei Hunden mit kognitiver Dysfunktion ein signifikant höherer fT3-Wert ermittelt. Die Schilddrüsenparameter T4, fT4 und T3 waren ebenfalls erhöht, jedoch nicht signifikant. Der Vergleich der Hunde in der Verhaltenskategorie Deprivation / mangelnde Sozialisation gegenüber der Referenzgruppe ergab keine signifikanten Unterschiede. Ein weiterführender Vergleich ausschließlich der Hunde mit Deprivation / mangelnder Sozialisation sowohl in Bezug auf Aggression als auch auf Angst ergab keine Unterschiede. Bei allen Analysen ist auffällig, dass die T4- und T3-Werte im unteren Drittel des Referenzbereiches lagen, der fT3-Wert sogar immer darunter. Der Vergleich zu einer Gruppe verhaltensunauffälliger Hunde könnte weiteren Aufschluss darüber geben, ob diese Veränderungen im direkten Zusammenhang mit den Verhaltensproblemen stehen, anderen Einflüssen wie Alter, Größe, usw. unterliegen oder die Referenzbereiche neu überdacht und rassespezifische Werte etabliert werden sollten. Die Ergebnisse zeigen, dass Verhaltensprobleme und Verhaltensstörungen beim Hund einen Bezug zu niedrigen Schilddrüsenparametern aufweisen. Außerdem konnten verschiedene Schilddrüsenparameter ermittelt werden, die bei einzelnen Verhaltensproblemen und Verhaltenstörungen verändert waren. Obwohl sich signifikante Unterschiede bei einzelnen Parametern ergeben haben, kann nicht bei einem einzelnen Individuum aufgrund veränderter Schilddrüsenparameter auf ein bestimmtes Verhaltensproblem bzw. eine Verhaltensstörung geschlossen werden, da die meisten Schilddrüsenwerte im unteren Referenzbereich lagen. Erniedrigte Schilddrüsenparameter können durch eine Vielzahl anderer Einflüsse bedingt sein.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufige (10%), spontane, immun-mediierte, wiederkehrende Entzündung des inneren Pferdeauges, die letztendlich zur Erblindung des betroffenen Auges führt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin stellt die ERU das einzige spontane Tiermodell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen dar, so dass Fortschritte in der Erforschung der ERU auch einen Beitrag für ein besseres Verständnis dieser Erkrankung beim Menschen leisten. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen am Zielorgan, die zur Entstehung der ERU und den rezidivierenden Entzündungsschüben führen, sind bis heute nicht geklärt. Durch seinen unmittelbaren Kontakt zur Retina ermöglicht der Glaskörper einen indirekten Einblick auf die in der Retina ablaufenden pathophysiologischen Prozesse und stellt ein wertvolles Probenmaterial bei der Erforschung vitreoretinaler Erkrankungen wie der ERU dar. Ziel dieser Arbeit war es, Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 119 Glaskörperproteine mittels LC-MS/MS identifiziert. Hiervon konnte durch eine Label-free Quantifizierung für 79 Proteine eine differenzielle Expression nachgewiesen werden. 17 Proteine zeigten eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben von an ERU erkrankten Pferden, wohingegen 62 Proteine in ihrer Expression vermindert waren. Durch die mit der Software STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) durchgeführte Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse konnten vier Cluster von Proteinen identifiziert werden, die bei der ERU verändert exprimiert werden. Neben einer Gruppe von Plasmaproteinen, einer aus Zelladhäsions-Proteinen bestehenden Gruppe und Proteinen des Wnt-Signalweges wurde erstmalig eine funktionell mit den Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 assoziierte Gruppe identifiziert, für deren Vertreter ebenfalls eine differenzielle Expression in der Pferderetina nachgewiesen wurde. Der Wnt-Inhibitor SFRP-2 war in den Glaskörpern von an ERU erkrankten Pferden vermindert nachweisbar und zeigte eine Assoziation mit der Expression seines Interaktors Wnt3a in der gesunden Pferderetina. Mit A2M konnte durch SF-TAP Aufreinigung ein bislang unbekannter Interaktor für SFRP-2 identifiziert und in Bezug zur ERU weiter charakterisiert werden. Für das Protein Osteopontin konnte eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben und Retinae der Kontrollpferde nachgewiesen werden. Rückblickend erwies sich die Protein-Netzwerkanalyse der durch LC-MS/MS identifizierten, differenziell exprimierten Proteine als geeignete Methode, um Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Weitere Experimente sind nun notwendig, um die funktionelle Bedeutung der neu identifizierten Proteine und der mit ihnen assoziierten Signalwege in der ERU zu evaluieren.

Der rechte Mesonephros, sein Ductus mesonephricus sowie drei Tubuli eines bovinen Embryo mit 35 mm SSL wurden aus 902 histologischen Einzelbildern am Computer rekonstruiert. Zur Verwendung kam die kommerzielle Software „Amira“. Die Arbeit wurde über einen Remote-Zugang auf den Rechensystemen des Leibniz-Rechenzentrums in Garching bei München durchgeführt. Die Schwierigkeiten und Grenzen der computergestützten Visualisierung aus kon¬ventionellen Schnittbildserien konnten gezeigt werden. Das Vorgehen mit physi¬kalischen Schnitten brachte vor allem Probleme beim Ausrichten der Schnitte sowie beim Zuordnen von Bildpunkten zu Strukturen mit sich. Bei der bearbeite¬ten histologischen Serie handelte es sich um archivierte Bilder. Diese waren zum Zeitpunkt ihrer Herstellung nicht zum Zwecke der Bearbeitung an einem PC be¬stimmt und daher nicht mit Markersystemen zur besseren Reorientierung aus¬gestattet. Konventionelle Schnittbildserien komplizierter Strukturen können also als Ausgangsdaten zur digitalen Weiterverarbeitung als nicht optimal bezeichnet werden. Im Ergebnis konnten jedoch mit größtenteils zeitaufwendigen, händi¬schen Verfahren dank der sehr guten Hardware-Performance befriedigende Er¬gebnisse erzielt werden. Diese bestätigten größtenteils die bisherigen Beschreibungen des Mesonephros. Hinweise auf einen kraniokaudalen Gradienten in der Entwicklung und Degene¬ration konnte ebenso gezeigt werden wie grundsätzliche morphologische Bezie¬hungen. Ein Nephron besteht aus dem medial gelegenen Glomerulum, dem ge¬streckten proximalen Tubulus und einem stark gewundenen, distalen Tubulus mit attachment-Zone in direkter Nachbarschaft zum Glomerulum. Ein unmittelbar unter der Organkapsel verlaufender, kollektiver Abschnitt mündet schließlich in den Wolffschen Gang. Die Stellung der Nephrone ist segmentübergreifend und nahezu senkrecht zum Verlauf des Wolffschen Gangs. Der mit der Visualisierung der Schnittbildserie verbundene hohe Zeitaufwand sowie die Notwendigkeit ständiger manueller Kontrolle zeigt deutlich, dass bis zum routinemäßigen Einsatz dreidimensionaler Techniken im lichtmikroskopi¬schen Forschungsbereich noch großer Handlungsbedarf besteht. 3D-Modelle sind in der Lage, Wissenschaftlern neue Einblicke und Zugänge zu gewähren sowie Studierenden den Lernstoff auf anschauliche Art und Weise zu vermitteln. Der Aufwand zu ihrer Herstellung muss jedoch in einem sinnvollen Verhältnis zu ihrem Nutzen stehen.