Establishment of a clonal immortalized human mesenchymal stem cell line expressing hTERT using lentiviral gene transfer

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch
lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen
Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs.
3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten
hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die
hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch
Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde
mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch
morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling
level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die
Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch
Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten
nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von
hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene
Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen
tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden
Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde
der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von
RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in
vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert.
Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und
“single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der
RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte
hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch
heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage
Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger
als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit
unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet
werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von
einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5,
PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen
in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies
war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht
transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte
sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und
spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6),
welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer
kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die
erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs
wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine
positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung,
Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und
Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur
Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der
hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine
Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte
RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen
werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten
sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation
der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo
keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser
Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion
von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode
zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist
die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch
längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in
Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital
hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die
Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen
zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.