Gezielte molekulare Therapie des Mantelzell-Lymphoms In vitro Wirksamkeit von mTOR-Inhibitor RAD001 und PNP-Inhibitor Forodesin+dGUO in Mono- und Kombinationstherapie

Das Mantelzell-Lymphom ist ein aggressives B-NHL, das durch die
Expression des Zell-zyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1
charakterisiert ist. Diese Expression wird in den meisten Fällen
durch eine chromosomale Translokation t(11;14)(q13;q32) ausgelöst.
Klinisch weist das MCL mit einem medianen Überleben von nur drei
bis vier Jahren eine der schlechtesten Langzeitprognosen aller
Lymphomsubtypen auf. In fortgeschrittenen Stadien kommt es zu
frühzeitigen Rezidiven nach der Behandlung mit konventionellen
Chemotherapeutika. Es besteht daher ein dringender Bedarf an neuen,
effektiveren, mo-lekular ausgerichteten Therapieformen, die zu
einer Verbesserung der Prognose und der Lebensqualität der
Patienten führen. In dieser Arbeit wurde hierfür das
Proliferationsverhalten und die Viabilität von sechs humanen
MCL-Zelllinien nach der Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor RAD001
und dem Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Inhibitor Forodesin in
Gegenwart von 2'-Desoxyguanosin (dGuo) untersucht. Im Vordergrund
stand zum einen die Charakterisierung der Wirkung von RAD001 und
Forodesin+dGuo als Monosubstanzen. Zum anderen war es auch Ziel,
die Antitumorwirkung zytotoxischer Kombinationen mit etablierten
Substanzen der Chemotherapie, dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib
sowie dem PKCß-Inhibitor Enzastaurin bezüglich Wachstumshemmung,
Zelltod und Apoptose zu untersuchen und diese Kombinationen auf
antagonistische, additive oder synergistische Interaktionen hin zu
analysieren. Die behandelten Zellen wurden hierzu einem
Viabilitäts-Trypanblau-Test unterzogen, der hier als
Screeningverfahren diente, um die Empfindlichkeit der Zellen auf
unterschiedliche Dosen in Einzel- und Kombinationstherapien zu
quantifizieren. Im Anschluss wurden die Resultate mit Hilfe der
Zellzyklusanalyse durch Propidiumiodid-Färbung und Apoptose-Assays
verifiziert und der Wirkmechanismus der Kombinationen
differenziert. Als Ergebnis dieser Arbeit erzielte der
mTOR-Inhibitor RAD001 als Monosubstanz bereits in subtoxischen
Konzentrationen vor allem nach 48- und 72-stündiger
Expositionsdauer eine antiproliferative Wirkung auf die
MCL-Zelllinien. Außerdem zeigte RAD001 bei allen in dieser Arbeit
untersuchten Zelllinien eine potente Inhibition des Zellzyklus, mit
einer Zunahme der G0/G1- und einer Abnahme der S-Phase. Nach
48-stündiger Behandlung mit RAD001 in Kombination mit Fludarabin,
Cytarabin, Bendamustin sowie Enzastaurin und Bortezomib zeigte sich
bei einer Zelllinie ein Syner-gismus, die im
Viabilitäts-Trypanblau-Test besonders empfindlich auf RAD001 war.
Additive Effekte konnten bei vier von fünf untersuchten
MCL-Zelllinien durch die Kombination von RAD001 und Bendamustin
nachgewiesen werden. Bei zwei von fünf Zelllinien konnten diese
Effekte auch mit Fludarabin erzielt werden. Vier von fünf
MCL-Zelllinien zeigten nach 48-stündiger Behandlung bei der
Kombination von RAD001 plus Cytarabin eine antagonistische Wirkung.
Die Behandlung mit der Kombination von RAD001 plus Bortezomib oder
Enzastaurin führte in einigen MCL-Zelllinien ebenso zu additiven
Effekten. Die Kombinationen RAD001 plus Forodesine+dGuo und RAD001
plus Bortezomib wiesen in drei von fünf MCL-Zelllinien dagegen eine
antagonistische Wirkung auf. Nach der Behandlung mit Forodesin
unter Beigabe von dGuo konnte ebenfalls eine anti-proliferative
Wirkung in allen untersuchten MCL-Zelllinien induziert werden. Die
weiteren Untersuchungen mithilfe von Zellzyklus- und
Apoptose-Analysen zeigten jedoch keine wesentlichen Veränderungen
im Vergleich zu der jeweiligen unbehandelten Kontrolle. Ganz anders
stellte sich die Zellzyklus-Analyse der T-ALL-Kontrollzelllinie
Jurkat dar. Hier zeigte sich eine deutliche
T-Zelllinien-spezifische Wirkung des PNP-Inhibitors Forodesin unter
Zugabe von 2'-Desoxyguanosin. Die Kombination von Forodesin+dGuo
und Bendamustin wies bei vier von fünf MCL-Zelllinien nach 72
Stunden Expositionszeit ebenso eine additive Wirkung auf. Ein
synergistischer Effekt war nach 48 Stunden dagegen lediglich bei
einer MCL-Zelllinie zu erkennen. Die Kombination von Forodesin und
Fludarabin zeigte schließlich nach 72 Stunden Expositionszeit bei
vier MCL-Zelllinien und der T-ALL-Zelllinie Jurkat eine
antagonistische Wirkung, was letztendlich auf das Konkurrieren der
Phosphorylierung von dGuo und Fludarabin zurückzuführen ist. Bei
vier von fünf untersuchten MCL-Zelllinien wies die Kombination von
Forodesin+dGuo und Bortezomib ebenfalls eine antagonistische
Wirkung auf, da die beiden Kombinationspartner um
DNA-Bindungsstellen konkurrieren. Eine additive Wirkung ließ sich
am Ende auch bei drei von fünf MCL-Zelllinien mit der Kombination
von Forodesin+dGuo plus Enzastaurin nachweisen. Zusammenfassend
wäre somit ein Einsatz des mTOR-Inhibitors RAD001 und des
Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Hemmstoffs Forodesin in Gegenwart von
2’-Desoxyguanosin additiv zu anderen Chemotherapeutika im Rahmen
der Mantelzell-Lymphom-Therapie durchaus vielversprechend.
Allerdings sind bei der Entwicklung dieser und weiterer,
in-novativer Kombinationen die zugrundeliegenden molekularen
Mechanismen zu beachten, um mögliche antagonistische Wirkungen zu
vermeiden.