Ex-vivo Effekte von Gerinnungsinhibitoren auf die zelluläre Immunfunktion nach Trauma

Sowohl aktiviertem Protein C (aPC) als auch Antithrombin (AT)
werden neben ihrer Bedeutung als physiologische
Gerinnungsinhibitoren immunmodulatorische Potenz zugeschrieben. Sie
scheinen daher geeignet, die gestörte Immunfunktion wie sie
beispielsweise nach Trauma beobachtet wird, günstig zu
beeinflussen. Dies könnte der Entstehung von septischen
Komplikationen durch eine gestörte Infektabwehr entgegen wirken
oder die Organsysteme vor den Folgen überschießender systemischer
Entzündungsreaktionen schützen. Während jedoch mittlerweile eine
große Anzahl klinischer und experimenteller Arbeiten zur Anwendung
dieser Substanzen vorliegt, sind die Wirkungen auf humane
Immunzellen nach wie vor nicht abschließend geklärt. Ziel dieser
Studie war daher die Charakterisierung möglicher Effekte von aPC
und AT auf die zelluläre Immunfunktion unter Berücksichtigung eines
sogenannten „Priming“ der Zellen durch vorausgehendes Gewebetrauma
(Operation oder schwere Unfallverletzung). Daneben sollte auch die
Frage einer möglichen Wechselwirkung von aPC und AT geklärt werden.
Außerdem wurde der Einfluss von Heparin auf ein
immunmodulatorisches Potential von AT untersucht. Im Rahmen der
vorliegenden kontrollierten ex-vivo Studie erfolgte der Einschluss
von zwölf viszeralchirurgischen sowie neun polytraumatisierten
Patienten. Als Vergleichskollektiv dienten zwölf gesunde Probanden.
An mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC), die mittels
Ficoll-Separation an den Tagen 1, 3 und 7 nach Trauma gewonnen
wurden, untersuchten wir den Einfluss von physiologischen (aPC 4 µg
/ ml, AT 1 IE / ml) oder supraphysiologischen (aPC 100 µg / ml, AT
20 IE / ml) Konzentrationen der Gerinnungsinhibitoren. Bei
operierten Patienten erfolgte präoperativ eine zusätzliche Abnahme.
Gesunde Probanden spendeten einmalig Blut und dienten als
Referenzgruppe. PBMC wurden in serumfreiem Medium kultiviert und
mit aPC bzw. AT (allein oder zusammen) für 60 Minuten präinkubiert.
Der entzündliche Stimulus erfolgte mit LPS bzw. OKT3. Zellkulturen
wurden dann mit oder ohne Stimulus für 20 Stunden (LPS) oder 72
(OKT3) Stunden inkubiert. Für die Zugabe ansteigender Heparindosen
erfolgte die analoge Herstellung von LPS-stimulierten Ansätzen mit
supraphysiologischer AT Konzentration. Die Messung der
Zytokinspiegel erfolgte mit dem Bioplex Suspension Array System aus
den Zellkulturüberständen. Bei gesunden Probanden konnten wir unter
LPS-Stimulation in Gegenwart von AT (20 IE / ml) signifikante
Abfälle sowohl von TNF-α als auch IL-10 beobachten. Im
Patientenkollektiv zeigte sich für TNF-α der gleiche Effekt. Für
IL-10 zeigte sich ebenfalls der bei gesunden Probanden beobachtete
Abfall der LPS-induzierten IL10-Spiegel, hier jedoch ohne
statistische Signifikanz. In unstimulierten Proben führte AT (20 IE
/ ml) zu einer signifikanten Erhöhung der TNF-α Spiegel. Ein Effekt
von AT in der Konzentration 1IE / ml konnte nicht gezeigt werden.
Für aPC konnte im LPS-Model kein Einfluss auf die Immunantwort von
PBMC unter serumfreien Bedingungen nachgewiesen werden. Nach
Aktivierung mit OKT3 kam es durch AT (20 IE / ml) zu einem teils
signifikanten Abfall von IFN-γ, und IL-13, wohingegen aPC (100 µg /
ml) zu einem Anstieg beider Zytokine führte. Sowohl AT als auch aPC
führten zu signifikant erhöhten IL-6 Spiegeln in OKT3-stimulierten
Ansätzen. Allerding erhöhte nur AT signifikant die Freisetzung von
IL-6 und IFN-γ in unstimulierten Ansätzen. Bei gleichzeitiger Gabe
von aPC und AT zeigten sich mit AT 20 IE / ml vergleichbare
Spiegel. In Ansätzen die Heparin enthielten zeigte AT (20 IE / ml)
eine unveränderte Reduzierung der IL-10 und TNF-α Spiegel. Unsere
Ergebnisse zeigen somit für beide Substanzen eine
immunmodulatorische Potenz in supraphysiologischen Konzentrationen.
Antithrombin führt ex-vivo mit Ausnahme von IL-6 und im Unterschied
zu aPC zu einer breiten Suppression der Zytokinfreisetzung aus
stimulierten PBMC. Mit Heparin in Dosierungen bis 200IE konnte
dieser Effekt nicht antagonisiert werden. Demgegenüber ist aPC in
einem serumfreien ex-vivo Modell ein Aktivator der lymphozytären
TH1-Antwort in humanen PBMC, hat also entgegen häufig postulierter
Vorstellungen klare proinflammatorische Effekte, zumindest auf
humane Immunzellen. Die klinische Bedeutung dieser Beobachtungen
und die zugrunde liegenden Mechanismen bedürfen der weiteren
Klärung.