Biochemische Charakterisierung der humanen Notch 1 und Notch 3 Rezeptoren und Analyse der Expression des humanen Notch 1 Rezeptors auf Zell-Linien und histologischen Präparaten

In der vorliegenden Arbeit sollten monoklonale Antikörper gegen die
extrazelluläre Domäne des humanen Notch 1 Rezeptors als Werkzeug
für weitergehende Untersuchungen hergestellt werden. Dazu konnte
erfolgreich ein Reinigungsprotokoll zur Aufreinigung eines
rekombinanten Proteins aus dem extrazellulären Teil von Notch 1
etabliert werden. Das Austesten der Antikörper ergab, dass diese
aufgrund von geringer Sensitivität im Western Blot nicht zu
verwenden waren. Auch im FACS konnten sie nicht eingesetzt werden,
da keine Bindung an natives Notch erfolgte. Daher wurde auf die
Verwendung von mittlerweile verfügbaren Antikörpern gegen die
intrazelluläre Notch Domäne zurückgegriffen. Damit konnte gezeigt
werden, dass Notch 1 Rezeptor auf allen untersuchten Proben von
primären Zellen exprimiert wird, sowie auf allen untersuchten
Zell-Linien. Unter Verwendung von Notch 3 Antikörpern wurde die
parallele Expression von Notch 1 und Notch 3 auf Zell-Linien
analysiert und festgestellt, dass auf T-Zell-Linien Notch 1 und
Notch 3 gleichzeitig exprimiert werden. Biochemische Untersuchungen
zeigten, dass Notch 3 wie Notch 1 einer S1 Prozessierung im
Golgi-Netzwerk zu unterliegen scheint. Mit den intrazellulär
bindenden Notch 1 Antikörpern konnte eine immunhistochemische
intrazelluläre Notch 1 Färbemethode etabliert werden, die eine
Untersuchung von (Tumor-) Gewebe erlaubte. Das unterschiedliche
Expressionsmuster von Notch lässt auf unterschiedliche Mechanismen
bei der Regulation von Zellwachstum und Differenzierung schließen.
So konnte in Tumoren der Haut keine Notch 1 Expression gesehen
werden, jedoch im Str. basale. In Zellen des Kolonadenoms dagegen
war eine Notch 1 Expression zu erkennen. Zusätzlich zu der bereits
in der Literatur ausführlich beschriebenen Rolle von Notch als
Onkogen tritt, abhängig vom untersuchten System, Notch auch in der
Rolle eines Tumorsuppressorgens auf. Allerdings kann durch eine
immunhistochemische Untersuchung der Notch 1 Expression allein
keine Aussage getroffen werden, ob eine Änderung der Notch
Expression Ursache für einen Transformationsprozess ist, oder als
Folge eines solchen Prozesses auftritt. Dennoch liefert die
parallele Untersuchung von gesundem und Tumor-Gewebe einen ersten
Hinweis auf eine wie auch immer geartetete Beteiligung des Notch
Signalweges. Prinzipiell ist bei der Interpretation auch zu
beachten, dass hier die Notch 1 Färbung keine Aussage über den
Aktivierungszustand von Notch liefern kann, da nicht gesichert ist,
ob und in welcher Quantität Notch im Zellkern mit dieser Methode
nachweisbar ist.