Vergleichende Untersuchungen zu frühen Wirt-Pathogen-Interaktionen bei akuter und subklinischer Mastitis des Rindes

Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste
Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus
(S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den
wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr
unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E.
coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während
S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis
subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen
wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der
entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe
Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene
zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen
in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht
untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem
Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der
Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter
dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den
Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen
es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren,
welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung
gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur
Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli
und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag
hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter
Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3
h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die
Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das
ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag
auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die
Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der
Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse
Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und
einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei
den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen
Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n =
6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein
Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von
Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange
inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der
Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert
werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen
Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den
Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der
Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene
Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die
Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte
Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die
bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine
Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache
festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten
3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich
1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme
wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um
deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli
erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von
1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ±
8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere
Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch
wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische
Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische
Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und
beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium
vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren
Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb
mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden
nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet
und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu
untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen
Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme
in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C
tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die
mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen
entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20,
S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die
Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden
Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in
vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle.
Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach
Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als
nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger
Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der
mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor
allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit
E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF
konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger
intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während
eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach
2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell
wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und
Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition
mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in
vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die
Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach
Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des
Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant
stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist
ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der
Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte
nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und
S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante
Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation
mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation
der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser
Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe
patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation
immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet
damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr
früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig
soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen
Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen
und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern
oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen
Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte
Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen
Mastitis zu finden.