Entwicklung einer Realtime-PCR zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. avium und Mycobacterium avium ssp. silvaticum beim Vogel

Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am
häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium
ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen
bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem
muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen
werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur
Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es
insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine
Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die
Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher
die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die
lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur
Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können
Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie
sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt
als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In
der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis
von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da
vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu
rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in
die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen
von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von
Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das
Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und
M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde
konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als
interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al.
(2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte
Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die
Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend
hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer
und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13
Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur
Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität
wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus
unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann
geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der
Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben,
18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus
Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer
Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen
Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so
eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s
auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle
wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von
Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der
Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition
der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme
wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen
Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und
M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a
gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine
Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was
rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz
entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach
Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105
Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich
keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien
handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als
negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von
Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12
asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch
mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung
durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von
säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels
Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden
Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der
vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von
M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von
klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von
Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere
die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die
Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt
wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen
Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.