Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19 Archiv

Deregulation of epidermal growth factor receptor (EGFR) pathways contributes to the progression of a wide range of cancers, and the EGFR is an attractive therapeutic target. The humanized EGFR-specific monoclonal antibody EMD72000 has shown potent inhibitory activity in preclinical experiments and is under investigation in clinical studies. Using the human L3.6pl pancreatic cancer cell line, we investigated whether the efficacy of EMD72000 can be enhanced in combination with gemcitabine. Nude mice were orthotopically injected with L3.6pl cells followed by biweekly treatment of 40 mg/kg EMD72000 and 100 mg/kg gemcitabine (either alone or in combination). Under two treatment schedules we evaluated a) the influence of different time points of initiation of single agent and combined treatment after tumor cell injection into nude mice and b) the influence of different treatment durations. In the first experiment, treatment was initiated at four different time-points after tumor cell injection (days 8 - 28). Exposure to EMD72000 or gemcitabine alone resulted in detectable tumor shrinkage and reduced lymph node and liver metastases, however, these effects were enhanced in the EMD72000 plus gemcitabine groups. Furthermore, combination treatment as well as EMD72000 monotherapy led to a significant reduction of microvessel density and tumor cell proliferation in primary pancreatic tumors following immunohistochemical analysis for CD31 and Ki67, respectively. Overall, the effects were strongest when treatment was initiated at early time points after tumor cell injection. In a second experimental set-up, treatment was initiated at day 8 after tumor cell injection in all cases and stopped at four different time-points (days 15 - 33). Interestingly, there was no significant difference in the average tumor weight of the groups treated for short versus longer time periods. The treatment was most effective when given shortly after tumor cell injection, whereas the duration of the treatment appeared less important in this model. In conclusion, in this model the anti-angiogenic and anti-tumor activity of EMD72000 in combination with gemcitabine was substantially more effective than either treatment alone.

Hintergrund: Diese Studie wurde durchgeführt, um Unterschiede in der zerebralen Aktivierung zwischen zwei Gruppen von einerseits Patienten mit leichten kognitiven Störungen (LKS) und andererseits gesunden Kontrollpersonen (GK) während eines verbalen Arbeitsgedächtnistests zu untersuchen. LKS wird als Vorstufe der Alzheimer Demenz angesehen. Um eine frühe Diagnose der Demenz zu ermöglichen, ist es wichtig, diagnostische Marker für LSK und AD zu etablieren. Methoden: Acht Personen mit LKS und acht GK haben sich einer funktionellen Magnetresonanztomographie unterzogen, während sie einen verbalen Arbeitsgedächtnistest durchführten. Sie bekamen fünf Buchstaben gezeigt, die sie sich nach der Einprägungsphase sechs Sekunden lang merken mussten, währenddessen sie ein Fixierungskreuz sahen. Nach dieser Verzögerung wurde den Probanden ein einzelner Buchstabe gezeigt, und sie mussten entscheiden, ob dieser Buchstabe in der vorher gezeigten Gruppe von Buchstaben enthalten war. Die Antwort erfolgte über Tasten in der rechten und linken Hand. Statistische parametrische Karten des Gehirns, die die Gehirnaktivität für die jeweiligen Gruppen zeigen, und Karten, die die Unterschiede zwischen beiden Gruppen zeigen, wurden für beide Gruppen erstellt. Ziele: Ziele der Studie waren, die Gehirnaktivierung von Patienten mit LKS und einer Gruppe von GK während eines verbalen Arbeitsgedächtnistests zu untersuchen, und Unterschiede in der Aktivierung zwischen den beiden Gruppen zu finden. Ergebnisse: Gehirnaktivierung in der GK-Gruppe wurde in dorsolateral-präfrontalen, parietalen und temporalen Gegenden beobachtet. Diese Aktivierungen wießen linksseitige Lateralisierung auf, was für verbale Aufgaben typisch ist. Trotzdem gab es auch aktive Regionen in der rechten Hemisphäre, was einen gewissen Grad von Delateralisierung bedeutet. Dies wiederum ist ein typischer Prozess der normalen Alterung. Die LKS-Gruppe wies Aktivierung in den gleichen Regionen auf, allerdings mit einem geringeren Grad an Delateralisierung. Es gab sowohl interhemisphärische wie auch interregionale Unterschiede in der Aktivierung zwischen den Gruppen. Die GK-Gruppe zeigte höhere Aktivierung in Regionen des Frontallappens, während die LKS-Gruppe höhere Aktivierung in Regionen des Termporallappens aufwies. In beiden Gruppen fanden sich Regionen, die höhere Aktivierung während der Ruhe-Phase des Tests im Vergleich zu der tatsächlichen Aufgabe zeigten. Diese Regionen werden ‚Default’-Netzwerk genannt. Die LKS-Gruppe hatte eine ausgeprägtere ‚Deaktivierung’ als die GK-Gruppe während der Wiederholungs-Phase des Tests, und eine niedrigere ‚Deaktivierung’ als die GK-Gruppe während der Entscheidungs-Phase. Ausblick: In beiden Gruppen war die Gehirnaktivierung während der verschiedenen Teile der Aufgabe in Gegenden, die während eines verbalen Arbeitsgedächtnistests typischerweise aktiviert werden. Es fanden sich Unterschiede in den Aktivierungsmustern zwischen den beiden Gruppen. Der auffallendste Unterschied war, dass die LKS-Gruppe höhere Aktivierung als die GK-Gruppe hatte, was auf Kompensierung für neurale Degeneration und kognitiven Leistungsabfall zurückgeführt werden kann. Dieser Kompensationsprozess trat während allen Teilen des Arbeitsgedächtnistests auf.

Wie kann der Gesetzgeber die Bevölkerung bedarfsgerecht mit Arzneimitteln versorgen und trotzdem die stetig steigenden Ausgaben der gesetzlichen Krankenversicherung in den Griff bekommen? Untersucht werden dazu jene Arzneimittelrichtgrößen nach §84 SGB V, die seit 1997 die Verordnungskosten für jeden einzelnen niedergelassenen Arzt budgetieren. Der Autor zeigt anhand der Indikationsgebiete ‘chronische Herzinsuffizienz’ und ‘primäre Kopfschmerzen’, dass die derzeitige Richtgrößensystematik durch einen Wechsel vom Kopfpauschalen- zum Krankheitsbezug verbessert werden kann. Darauf aufbauend schlägt er ein Modell zur Berechnung solcher morbiditätsbezogener Arzneimittelrichtgrößen vor, welches nicht nur die theoretischen, sondern auch die praktischen Anforderungen an ein effektives Regulierungsinstrument erfüllt. Das vorliegende Buch bietet Lösungen für die Ausgestaltung der Arzneimittelversorgung zwischen Effizienz und sozialer Gerechtigkeit an. Es liefert damit einen wertvollen Beitrag für die beständig aktuelle Gesundheitspolitikdebatte.

The deposition amyloid β peptide in the brains of patients is a hallmark of Alzheimer’s disease and is thought to play a major pathogenetic role in the development of the demential symptoms of this severe illness. The amyloid β peptide is generated from the β-amyloid precursor protein (APP) by cleavage of the “β-site APP-cleaving enzyme” (BACE) followed by cleavage of the "gamma-secretase”. Whereas it has recently been discovered that the gamma-secretase is a multi-protein complex, it has not yet been investigated whether under native conditions, BACE functions in association with other proteins. The present work thus studied BACE by means of blue native gel electrophoresis and found that native BACE has a molecular weight of 140 kDa, whereas BACE under denaturing conditions has a molecular weight of 70 kDa which is only half of its native mass. Co-immunoprecipitation experiments with differently tagged full-length BACE constructs subsequently showed that this higher molecular weight species of BACE corresponds to a BACE homodimer. In contrast, a BACE ectodomain, lacking the C-terminus and the transmembrane domain, is a monomer. A consecutive domain analysis revealed that both the C-terminus and the transmembrane domain of BACE are dispensable for dimerization. In line with this, it could be shown that the ectodomain of BACE can dimerize if it is attached to the membrane by a GPI anchor. In terms of the cellular localization of the dimerization process, it could furthermore be demonstrated that retention of BACE in the ER by addition of a KKXX-motif does not prevent dimerization. This suggests that dimerization can occur prior to full maturation of BACE which takes place in the Golgi apparatus. In addition, kinetic analyses of the purified native BACE dimer revealed a higher affinity and turnover rate for an APP-like substrate in comparison to the monomeric soluble BACE ectodomain. This suggests a putative function of dimerization in improving enzymatic efficiency. The implication of these findings for our understanding of the Amyloid-β synthesis as well as for a putatively alternative therapeutic strategy are discussed.

BACKGROUND: Eradication of Pseudomonas aeruginosa in patients with cystic fibrosis (CF) is possible if initiated early in the course of colonisation. To detect P aeruginosa as early as possible is therefore a major goal. This study was undertaken to validate a commercialised test for the detection of serum Pseudomonas antibodies in patients with CF. METHODS: A representative cross sectional analysis of serum antibodies against three Pseudomonas antigens (alkaline protease, elastase, and exotoxin A) was performed in 183 patients with CF of mean age 16.7 years and FEV1 85.9% predicted. The results were correlated with microbiological results from the previous 2 years to calculate sensitivity, specificity, positive and negative predictive values. The following 2 years were assessed to determine prognostic predictive values. RESULTS: A combination of all three tested antibodies yielded the best results with a sensitivity of 86%, specificity of 96%, and a positive predictive value of 97%. These values were higher if only patients in whom sputum cultures were available were considered (n = 76, sensitivity 95%, specificity 100%, positive predictive value 100%). The prognostic positive predictive value was high in intermittently infected patients (83%) but low in patients free of infection (33%), whereas the prognostic negative predictive value was high in patients free of infection (78%) and low in intermittently infected patients (58%). CONCLUSIONS: Regular determination of serum antibodies may be useful in CF patients with negative or intermittent but not with positive P aeruginosa status. A rise in antibody titres indicates probable infection and eradication treatment may be initiated even in the absence of microbiological detection of P aeruginosa.

Die Schizophrenie ist eine schwerwiegende chronische psychiatrische Störung mit noch weitgehend ungeklärter multifaktorieller Ätiologie bei einer ausgeprägten Heritabilität und einem Lebenszeiterkrankungsrisiko von annähernd 1%. Bei der Suche nach kausalen chromosomalen Loci und Genen wurden multiple Gene mit jeweils nur geringen Beiträgen zur Entstehung und Ausprägung der Erkrankung gefunden. Bisher gelang aber noch kein Nachweis von klar pathogenetischen Mutationen. Eine definitive Bestätigung von spezifischen Genen als wahre Suszeptibilitätsgene für die Schizophrenie könnte das pathogenetische Verständnis verbessern und den Fortschritt in der gezielten Entwicklung neuer Medikamente sowie letztendlich in der Prävention unterstützen. RGS4 ist ein Kandidatengen auf Chromosom 1, das sowohl in Kopplungs- wie auch Assoziationsstudien als Risikogen für Schizophrenie identifiziert wurde. Die RGS-Familie spielt eine signifikante Rolle in der Signalübertragung. Außerdem verbindet sie Rezeptoren, Effektoren und andere postsynaptische rezeptor- regulierende Komponenten und ist in Mechanismen der Neuroplastizität involviert. RGS4 ist am Konvergenzpunkt von mehreren Gi-, G-olf und Gq-gekoppelten Signaltransduktionswegen situiert und reguliert die Aktivität verschiedener Neurotransmittersysteme, wie z. B. von Dopamin-, Serotonin- und Glutamatrezeptoren. Die Expression von RGS4 im Neokortex ist hoch und bei schizophrenen Patienten signifikant verringert. In verschiedenen Assoziations- und Kopplungsstudien wurden signifikante Assoziationen zwischen RGS4 und Schizophrenie gefunden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Fall-Kontroll-Assoziationsstudie zur Untersuchung der Beziehung zwischen drei Einzel-Nukleotid-Polymorphismen des RGS4-Gens und der Schizophrenie an 184 deutschen schizophrenen Patienten und 184 deutschen gesunden Kontrollprobanden durchgeführt. Die drei SNPs (rs2661319, rs951436, rs951439) wurden von Chowdari et al. (2002) in einer familienbasierten Assoziationstudie als mit der Schizophrenie signifikant assoziiert beschrieben. Da es sich dort um ein amerikanisches und ein indisches Kollektiv handelte, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob sich die Ergebnisse in einem deutschen Kollektiv replizieren lassen. Bei der Untersuchung von Allel- und Genotypfrequenzen konnte in der deutschen Population keine Assoziation mit der Schizophrenie ermittelt werden. Die naheliegentste Erklärung für die Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Arbeit und denen von Chowdari et al. ist die, dass es in den amerikanischen und indischen Populationen andere Risikoallele gibt, als in der deutschen. Eine weitere Ursache könnte das unterschiedliche Testverfahren sein, da hier eine Studie mit nicht verwandten Kontrollprobanden gegenüber der Studie von Chowdari et al. die mit elterlichen Kontrollen durchgeführt wurde. Trotz einer sehr sorgfältigen Auswahl sowohl des Patienten- als auch des Kontrollkollektivs in dieser Studie könnten auch diagnostische Unterschiede verantwortlich sein. Sowohl die Heterogenität der Krankheit, als auch die Heterogenität der sie möglicherweise verursachenden Gene sind weitere Gründe für differierende Resultate.

Einleitung: Im Klinikum Innenstadt der Ludwig-Maximilians-Universität München werden herztransplantierte Patienten im Rahmen der nachsorglichen Betreuung in regelmäßigen Abständen sonographisch untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, bei einem dort regelmäßig betreuten Patientengut Infektionen, Neoplasien und andere unerwünschte Wirkungen der Immunsuppression wie vor allem die anhand der routinemäßigen Abdominalsonographien erhobenen pathologischen Befunde und morphologischen Organveränderungen deskriptiv zu dokumentieren. Dadurch soll ein Eindruck von der klinischen Relevanz der routinemäßigen Abdominalsonographie als Screening-Methode in der Nachsorge bei herztransplantierten Patienten zur frühzeitigen Erfassung pathologischer Befunde infolge immunsuppressiver Medikation geschaffen werden. Methode: Das Patientengut der vorliegenden Studie bestand ausschließlich aus herztransplantierten Patienten, die zur Vermeidung einer Transplantatabstoßung eine immunsuppressive Medikation erhielten und zwar als Kombination aus den immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A oder Tacrolimus, Azathioprin, Mycophenolat mofetil und Prednisolon. Insgesamt handelte es sich um 122 Patienten, die im Zeitraum von 1983 bis 1999 ein Spenderherz erhalten haben und von denen 85 Cyclosporin und 37 Tacrolimus als Basisimmunsuppressivum bekamen. Dazu wurden die pathologischen Befunde des Gesamtkollektivs ein Jahr, drei Jahre und fünf Jahre nach Herztransplantation des jeweiligen Patienten graphisch dargestellt. Zusätzlich zu den pathologisch-morphologischen sonographischen Befunden sollten auch die Häufigkeitsverteilungen der Neoplasien, opportunistischen Infektionen, das Neuauftreten von Diabetes mellitus, arterieller Hypertonie, Hyperlipidämie, Hyperurikämie, koronarer Herzkrankheit, peripherer arterieller Verschlusskrankheit sowie das Auftreten einer transitorischen ischämischen Attacke nach Herztransplantation dokumentiert werden. Abgesehen von den Häufigkeitsverteilungen im Gesamtkollektiv sollten auch die Häufigkeitsverteilungen in der Cyclosporin-Gruppe und der Tacrolimus-Gruppe angegeben werden. Von einem Vergleich dieser beiden Gruppen mit Signifikanzberechnungen sollte jedoch aufgrund mannigfaltiger Einflussgrößen abgesehen werden. Ergebnisse: Fünf Jahre nach Transplantation ergaben sich im Gesamtkollektiv unter anderem folgende Befunde: • 38,5 % Cholelithiasis • 9,0 % Cholezystitis • 21,3 % Hepatomegalie • 51,6 % Echogenitätserhöhung der Leber (Fettleber) • 36,1 % Größenabnahmen der Nieren • 86,9 % Echogenitätserhöhung der Nieren • 76,2 % Verminderung der Parenchymbreite der Nieren • 77,0 % Niereninsuffizienz im Stadium der kompensierten Retention • 9,8 % Niereninsuffizienz im präterminalen bzw. terminalen Stadium • 17,2 % sekundärer Hyperparathyreoidismus • 27,0 % Osteoporose • 19,7 % Pankreaslipomatose • 23,8 % Splenomegalie • 38,5 % Aortensklerose • 27,0 % maligne Entartungen • 52,5 % opportunistische Infektionen • 70,5 % Neuauftreten von arterieller Hypertonie • 65,6 % Neuauftreten von Hyperlipidämie • 16,4 % Neuauftreten der koronaren Herzkrankheit (KHK) • 18,0 % Neuauftreten der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) • 5,7 % Erstmanifestation einer transitorischen ischämischen Attacke (TIA) Schlussfolgerung: In Anbetracht der Häufigkeit der anhand serieller Sonographien frühzeitig erfassbaren pathologisch-morphologischen Veränderungen der Abdominalorgane ist zu schließen, dass die in regelmäßigen zeitlichen Intervallen durchgeführte Sonographie, eine kostengünstige und nicht-invasive Untersuchung, fester Bestandteil der nachsorglichen Betreuung (herz-) transplantierter Patienten sein sollte. Die möglichst frühzeitige Detektion pathologisch-morphologischer Veränderungen der Abdominalorgane ermöglicht dem behandelnden Arzt, rasch entsprechende Maßnahmen zu ergreifen, um eine weitere Verschlechterung der krankhaften Befunde zu verhindern bzw. wenigstens zu verzögern. So kann beispielsweise nach sonographischer Erfassung einer pathologisch verringerten Parenchymbreite der Nieren, die mit der Nephrotoxizität des verabreichten Calcineurin-Inhibitors Cyclosporin oder Tacrolimus im Zusammenhang stehen kann, das nicht nephrotoxische Mycophenolat mofetil (eventuell im Austausch gegen Azathioprin) in die immunsuppressive Kombinationstherapie integriert werden, was eine schrittweise Reduzierung der Erhaltungsdosis des nephrotoxischen Calcineurin-Inhibitors ermöglicht.

Eine Reihe von klinischen und experimentellen Studien deutet auf eine verschlechterte Wundheilung nach Trauma und Schock hin. Dafür scheint die verminderte Funktion der Wundimmunzellen verantwortlich zu sein. Wie bereits in klinischen und experimentellen Studien gezeigt werden konnte, führt eine Verabreichung der Aminosäure L-Arginin zu einer Normalisierung der Wundimmunzellfunktion unter diesen Bedingungen. Es blieb jedoch unbekannt, ob die Aminosäure auch die Wundheilung nach traumatisch hämorrhagischem Schock verbessert. Um dies zu untersuchen wurde an männliche C3H/HeN Mäuse einer Mittellinienlaparotomie durchgeführt, um so ein Weichteiltrauma zu induzieren. Anschließend wurden Polyvinyl-Schwämmchen subkutan an der Wunde implantiert und die Tiere wurden einem blutdruckkontrollierten hämorrhagischen Schock unterzogen. Dabei wurde der mittlere arterielle Blutdruck von ursprünglich 905 mmHg für 90 Minuten auf 355 mmHg gesenkt. Die Kontrollgruppe erhielt lediglich eine Laparotomie. Während der anschließenden Phase der Flüssigkeitstherapie erhielten die Tiere die vierfache Menge des abgenommenen Blutvolumens entweder in Form von reiner Ringer Lacktat Lösung oder zusätzlich mit 300 mg / kg Körpergewicht L-Arginin. Sieben Tage später wurde in der Wundflüssigkeit die Menge an Hydroxyprolin, einem Metabolit der Kollagensynthese, mittels Gaschromatographie gemessen. Ebenso wurde Kollagen I und III sowie TGF-β in der Wunde mittels Western Blot Analyse bestimmt. Zusätzlich wurde an separaten Tieren, zehn Tage nach hämorrhagischem Schock die Reißfestigkeit der Wunde mittels eines Tensiometers festgestellt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Hydroxyprolin nach hämorrhagischem Schock signifikant erniedrigt war. L-Arginin hingegen vermochte dieses Defizit an Hydroxyprolin auszugleichen. Ebenfalls zeigte sich durch L-Arginin eine Normalisierung des unterdrückten Kollagen I und III Gehalts in der Wunde nach Schock. TGF-β war sieben Tage nach Schock nicht signifikant verändert. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass die Verminderung der Reißfestigkeit der Wunde nach Trauma und Schock durch L-Arginin verbessert werden kann. Zusammenfassend konnte deutet diese Arbeit darauf hin, dass die Verabreichung der Aminosäure L-Arginin nach hämorrhagischem Schock zu einer Verbesserung der Wundheilung führt. L-Arginin könnte somit eine neue und effektive Methode zur Ergänzung der Flüssigkeitssubstitution nach Trauma und Blutverlust darstellen, um die Rate an Wundkomplikationen zu reduzieren.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Phospholipids form the matrix of plasmamebranes (PM) consisting of an asymmetric lipid bilayer. The high amounts of sphingolipids and cholesterol in the PM are furthermore the basis to form liquid-ordered domains / rafts by saturated long chain fatty acid interactions. Hence, the lipid trafficking pathways enabling the membrane biogenesis and lateral segregation into membrane compounds remain largely undefined. Here we could demonstrate that the scavenger receptor CD36 selectively mediates the lipid uptake of sphingomyelin (SM) and phosphatidylcholine (PC) into PM in an endocytosis independent way. In human monocytes we could further show that the selective phospholipid uptake for SM, PC and phosphatidylethanolamine was almost exclusively promoted by CD36 and SR-BI. Whereas CD36 was mainly localized in rafts, we found about 2/3rds of SR-BI located in non-rafts. Thereby, the main cell entrance for phospholipids and cholesterol was mediated by SR-BI into non-raft compartments. SR-BI was then internalized by clathrin-coated pits and promoted the formation of intracellular microdomains in early endosomes by recruitment of the newly acquired raft lipids. Thus, we propose a leading role for SR-BI in generating new rafts by the incorporation of the raft building lipids SM and cholesterol. These may provide a pool for the regeneration of raft domains within the PM.

1. Fragestellung: Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war zum einen die Untersuchung des tatsächlichen Einflusses verschiedener nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Thrombozytenfunktion und zum anderen der Vergleich der hier angewandten Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Praktikabilität im klinischen Alltag. Während die Thrombozytenaggregationshemmung für Acetylsalicylsäure schon lange bekannt ist, sind Daten oder Aussagen zu einer Reihe von anderen Analgetika nach wie vor unklar. Diese Fragestellung interessierte uns insbesondere vor dem Hintergrund der onkologischen und hämatologischen Patienten, bei denen häufig eine krankheits- oder medikamentenbedingte Thrombozytopenie besteht, und die andererseits häufig auf schmerzstillende oder fiebersenkende Medikamente angewiesen sind. Ausserdem sollte die Dauer einer Thrombozytenfunktionsstörung nach Einnahme von NSAIDs untersucht werden. 2. Methoden Wir untersuchten 5 nichtsteroidale Antiphlogistika an gesunden Probanden. Die Medikamente waren ASS, Ibuprofen, Paracetamol, Diclofenac und der selektive COX-2 Hemmer Rofecoxib. Zunächst wurde an Tag 0 die Thrombozytenfunktion der Probanden ohne Einfluss eines Medikamentes gemessen. An Tag 1, 2 und 3 nahmen die Probanden eines der genannten Medikamente ein. An Tag 4, 5 und 6 wurde die Thrombozytenfunktion im Verlauf gemessen. Die angewandten Methoden waren die Durchflusszytometrie, die Aggregometrie, die Thrombelastographie und der Platelet function Analyser -100. Die Durchflusszytometrie ermöglicht Aussagen über die Plättchengröße, die Plättchengranularität und Glykoproteinexpression an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Aggregometrie erlaubt Aussagen über das Aggregationsverhalten der Thrombozyten nach Stimulation durch ADP oder Kollagen. Die Thrombelastographie ist in der Lage, die Geschwindigkeit der plasmatischen Gerinnung, der Koagelbildung und die Festigkeit des Blutgerinnsels zu messen. Der PFA-100 ist ein Analysesystem, das den Prozess der Thrombozytenadhäsion und Thrombozytenaggregation nach einer Gefäßverletzung simuliert. Sozusagen eine Messung der Blutungszeit in vitro, die das Erkennen von ererbten, erworbenen oder durch Thrombozytenaggregationshemmer induzierte Thromozytenfunktionsstörungen ermöglicht. 3. Ergebnisse In der Durchflusszytometrie zeigte sich nach der Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac eine vermehrte Expression von P-Selektin an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Expression des Glykoproteins GPIIb/IIIa war überraschenderweise nach Einnahme von Rofecoxib statistisch signifikant vermindert. Bei der Untersuchung der Blutungszeit in vitro mit dem PFA-100 fanden sich statistisch signifikante Verlängerungen der Blutungszeit nach Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac. Paracetamol und Rofecoxib nahmen keinen Einfluss auf die Blutungszeit. In der Aggregometrie ließ sich nur nach Einnahme von ASS ein signifikanter Einfluss auf die Menge der benötigten, die Aggregation auslösenden, Stimulantia nachweisen. Die weiteren Medikamente hatten keinen Einfluss. In der Thrombelastographie zeigte sich eine Verlängerung der plasmatischen Gerinnung nach Einnahme von ASS, Diclofenac und Rofecoxib. 4. Zusammenfassung Im Vergleich der hier angewandten Methoden stellte sich heraus, dass im klinischen Alltag der PFA-100 und die Aggregometrie als wegweisende Methoden für die Entdeckung eventueller Gerinnungsstörungen nach Einnahme von NSAIDs als Methoden der Wahl anzusehen sind. Die Thrombelastographie ist aufgrund der Dauer bis zu einem Ergebnis zu langsam und aus den Veränderungen in der Durchflusszytometrie lassen sich nicht zwangsläufig Thrombozytenfunktionsstörungen ableiten, die zu veränderten Blutungsneigungen führen können. Außerdem ist die Durchflusszytometrie auch die aufwendigste und teuerste der hier durchgeführten Methoden. In der Zusammenschau ist also dem PFA-100, und in zweiter Linie der Aggregometrie, der Vorzug in der Untersuchung der Throm-bozytenfunktion - nach Einnahme von NSAIDs - hinsichtlich einer Aussage über die Blutungsgefahr zu geben. Von den untersuchten Medikamenten hatte der selektive COX-2 Inhibitor Rofecoxib und das nicht steroidale Antiphlogistikum Paracetamol den geringsten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion. Eine Empfehlung zur Schmerztherapie bzw. fiebersenkenden Therapie bei blutungsgefährdeten Patienten geht also zum Einsatz von Paracetamol oder einem Medikament aus der Gruppe der COX-2 Inhibitoren.

Die Entstehung eines frühen Säugerembryos aus je einer Ei- und Samenzelle ist ein zell- und molekularbiologisch bedeutsamer Abschnitt des Fortpflanzungsgeschehens und steht wegen der Fülle möglicher biotechnologischer und therapeutischer Anwendungen vor allem in den Bereichen Zelltherapie und Reproduktionsmedizin im Brennpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Dieser Abschnitt ereignet sich auf der zellulären Ebene und lässt sich als gameto-embryonaler Übergang zusammenfassen. Ausgehend von der Auffassung, dass die zeitlich unumkehrbare Generationenabfolge in ihrer Gesamtheit als ein kontinuierlicher Fluss von Zeichenprozessen (Semiosen) angesehen werden kann, stellt sich die Frage, ob der gameto-embryonale Übergang als semiotisches Geschehen interpretierbar ist. Um diese These zu überprüfen, werden zunächst die Grundlagen der Semiotik, die Entwicklung und das Konzept der Biosemiotik, das allgemeine Modell der Semiose nach KRAMPEN und der aktuelle Stand der naturwissenschaftlichen Forschung zum gameto-embryonalen Übergang dargestellt und die hierbei beschriebenen Strukturen und Prozesse diesem allgemeinen Modell eines semiotischen Prozesses zugeordnet. Demnach nimmt die Oozyte als Interpret durch einen semiotischen Kanal das Spermium als Zeichenvehikel wahr und das rezipierte Zeichen wird in Form des männlichen Vorkerns im oozytären Organismus repräsentiert. Dieses Ereignis markiert den Subjektwechsel von der reifen Oozyte zur Zygote; der zelluläre Organismus der Zygote entspricht wegen seiner maternalen Herkunft im Wesentlichen dem der Oozyte und wirkt als Interpretant. Dieser stellt über die Repräsentation des Objektes im Interpreten – die DNA-Sequenz – gemäß dem genetischen Kode eine Verbindung zu den Genprodukten her, die als das Objekt der Zeichenrelation anzusehen sind. Noch während der Integration paternaler Anteile in das zu bildende embryonale Genom und dessen Aktivierung beginnt mit den Furchungsteilungen die Entwicklung des neu entstandenen Menschen. Die methodenkritische Beurteilung ergibt, dass sich die vorgenommene Interpretation als standardisiertes Verfahren zur Anwendung semiotischer Begriffe in der Biologie eignet und dass der gameto-embryonale Übergang als Zeichenprozess beschrieben werden kann. Daraus folgen Implikationen für verschiede medizinische und philosophische Fragestellungen. Besonders die Reprogrammierung im Rahmen der Konstitution und Aktivierung des embryonalen Genoms, die nicht auf der genetischen Ebene, sondern epi-genetisch erfolgt, offenbart die Notwendigkeit eines Subjektes, das seine Umgebung aktiv interpretiert. Die semiotische Analyse zeigt, dass der zelluläre Organismus der Oozyte den Informationsgehalt des paternalen Vorkerns durch den Prozess des „Empfangens“ im Rahmen der epigenetischen Reprogrammierung aktiv verändert. Nicht das Genom bestimmt die Entwicklung des neuen Organismus, sondern die Interpretation des Genoms durch ein zelluläres Subjekt. Konstruktivistische Grundannahmen sind damit bereits auf dieser Ebene des Lebendigen erkennbar. Die semiotische Interpretation des gameto-embryonalen Übergangs eröffnet ein Verständnis für die Generationenabfolge als Zeichenfluss und lässt damit den einzelnen Menschen als Bindeglied zwischen seinen Eltern und zwischen zwei aufeinander folgenden Generationen erscheinen. Menschliches Leben ist – in immer wiederkehrender Folge – demnach nicht lediglich das Produkt biologischer Abläufe, sondern zugleich das Er-Zeugnis und damit das Zeichen für eine bestimmte, vorausgegangene Paarbeziehung in der menschlichen Sozialwelt. Dieses umfassendere Verständnis menschlichen Lebens nähert sich unserer lebensweltlichen Erfahrung an, begründet eine Sicht des einzelnen Menschen als bio-psycho-soziales Subjekt und fördert damit eine Heilkunde, die sich an den ganzheitlichen Bedürfnissen des Menschen auszurichten hat.

Das Pringle-Manöver wird seit fast 100 Jahren zur Vermeidung stärkerer Blutverluste bei Leberteilresektionen eingesetzt. Dagegen ist die ischämische Präkonditionierung ein erstmals vor ca. 30 Jahren beschriebenes Verfahren, um Organe vor Ischämie-Reperfusionsschäden zu schützen. Diese prospektive, randomisierte klinische Studie berichtet über die intraoperativen hämodynamischen Effekte des Pringle-Manövers und der ischämischen Präkonditionierung im Rahmen elektiver Leberteilresektionen. Der Studie liegt die Frage zugrunde, ob eine zusätzliche Ischämie und Reperfusion, die für die ischämische Präkonditionierung notwendig sind, nicht zu einer zusätzlichen und womöglich schwerer beherrschbaren hämodynamischen Situation führen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass das Pringle-Manöver zur Leberteilresektion eine Verringerung des Blutverlustes während der Leberoperation ermöglicht. Dieser positive Aspekt wird durch eine arterielle Hypotonie in der Reperfusionsphase als Folge einer systemischen Vasodilatation geschmälert. Eine Vorbehandlung der Leber mit der ischämischen Präkonditionierung mildert die unerwünschte postischämische makrohämodynamische Reperfusionsreaktion ab gezeigt durch einen geringeren Bedarf an Vasopressoren ( Noradrenalin). Darüber hinaus hebt die ischämische Präkonditionierung die blutsparende Wirkung des Pringle-Manövers nicht auf, sondern schützt die Leber vor einer Schädigung durch die warme Ischämie-Reperfusion. Somit gewährleistet die ischämische Präkonditionierung zum einen eine bessere intraoperative Kreislaufstabilität und zum anderen anti-ischämische, hepatoprotektive Wirkungen, ohne den Vorteil des Pringle-Manövers, den intraoperativen Blutverlust zu reduzieren, zu beeinträchtigen.