Untersuchungen zur Rolle der Rezeptortyrosinkinasen FLT3, DDR1 und DDR2 in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine
sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3
sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen
aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML
zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür
notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen
in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem
duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD
die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in
Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise
beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider
Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit
untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen
AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion
das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten
Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche
Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten
Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die
Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen
und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte
gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro
wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser
vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem
bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in
vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt
werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden
Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die
schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen
und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur
schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert
zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1-
und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem
Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor
überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil
gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben
aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe
FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der
FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb
wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen
Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher
FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen
FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen
Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe
des Dual-Luciferase Reporter Assay Systems wurden PAX5 als
schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors
bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf
gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine
Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist,
führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die
Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre
Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere
Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache
der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe
von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der
Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den
Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit
wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und
transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes
Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren.
Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen
transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine
konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten
(G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3
Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in
Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren
sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere
funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der
Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass
Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche
Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da
Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für
therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer
Bedeutung.