Untersuchung der putativen Interaktion der Hyaluronansynthase mit dem Aktinzytoskelett in humanen mesenchymalen Stammzellen

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von
vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die
Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44
(cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated
motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf
die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf
den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der
Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist
somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase
als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind
komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA
verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt:
HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer
Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität,
Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus
der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation
durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung
berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur
Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit
diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als
möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu
diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT
immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die
sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert
mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die
Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert.
Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als
auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden
Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der
stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand
verschiedener Methoden untersucht. Mittels
Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und
HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen
wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels
RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen,
dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und
SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil
exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem
HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten
Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten
HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien
eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die
Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von
allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war
deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der
HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung
zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die
HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden
Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44
durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an
Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu
erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies
bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der
Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der
HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte
außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen
Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche
Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen
wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie
lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern
im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war,
dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren,
die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine
Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in
lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den
doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin
stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre
Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und
sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen
Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine
Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett
untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus
kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei
Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend
werden.