Zwei-Photonen-Endomikroskopie

In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für die
Zwei-Photonen-Endomikroskopie untersucht. Die Herausforderung liegt
in der Miniaturisierung der Technik der Zwei-Photonen-Mikroskopie,
um auch endoskopisch in vivo hochauflösende Bilder von
Gewebestrukturen und Zellen zu erhalten. Im Gegensatz zur
Gewebeentnahme bei einer Biopsie ist dieses optische Verfahren
minimal-invasiv. Damit ist eine Vorab Untersuchung des Gewebes
möglich, die die Diagnostik unteranderem von bösartigen
Gewebestrukturen präzisieren könnte. Die konfokale Endoskopie
bietet bereits mit einem vergleichbaren Verfahren die Möglichkeit
einer optischen Biopsie an der Oberfläche, z.B. an verschiedenen
Schleimhäuten. Aufgrund der Gewebestreuung ist die Eindringtiefe
des Lichts dabei aber auf wenige Mikrometer begrenzt. Diese
Einschränkung könnte durch die bereits in der
Zwei-Photonen-Mikroskopie gezeigte größere optische Eindringtiefe
durch die Zwei-Photonen-Endomikroskopie verbessert werden. In
dieser Arbeit wurde ein Femtosekundenlaser durch Glasfasern
geleitet und am distalen Ende mit Hilfe einer Mikrooptik
fokussiert. Dazu wurde ein Aufbau basierend auf Faserbündeln
gewählt. Die einzelnen Faserkerne des Glasfaserbündels wurden mit
einem Galvanometer-Scanner abgerastert und die dazugehörige
detektierte Fluoreszenz punktweise zu einem Bild zusammengesetzt.
Zur Kompensation der zeitlichen Verbreiterung der Pulse wurde ein
Gitterkompressor aufgebaut. Mit diesem Aufbau wurden
Zwei-Photonen-Fluoreszenz Aufnahmen von fluoreszenzstarken Proben
durch ein Faserbündel ermöglicht. Diese Arbeit zeigt die
Machbarkeit der Zwei-Photonen-Endoskopie und zeigt Möglichkeiten
zur Optimierung, um zukünftig auch einen klinischen Einsatz zu
ermöglichen. Mit der verwendeten Mikrooptik wurde eine zelluläre
Auflösung von (3,5 ± 0,3) μm lateral und (5,3 ± 0,1) μm axial
erreicht. Durch die Verwendung eines Referenzsystem aus
Mikroskopobjektiven im Austausch der Mikrooptik konnte gezeigt
werden, dass vor allem die laterale Auflösung noch verbessert
werden konnte. Entscheidend ist hierfür eine hohe distale
numerische Apertur. Der zukünftige Einsatz von verbesserten
Mikrooptiken kann somit die Auflösung noch erhöhen. Aktuelle
Forschungsergebnisse legen nahe, dass diese zukünftig auch
kommerziell erhältlich sein könnten. Zusätzlich wurde eine variable
Fokussiereinheit auf Basis eines Drahts aus einer
Formgedächtnislegierung (Nitinol) realisiert. Damit konnte der
Abstand zwischen Mikrooptik und Gewebeoberfläche verstellt werden.
Durch Applikation eines maximalen Stromes bis zu 385mA kontrahiert
der Nitinoldraht um ca. 1,8%. Ab dem minimalen Aktivierungsstrom
von 330 mA konnte ein linearer Zusammenhang zwischen der
Stromstärke und der Verschiebung beobachtet werden. Eine Änderung
der Stromstärke in Schritten von 16–12 mA. ermöglicht eine
Verschiebung von 20–10 μm. Eine Herausforderung ist die Erzeugung
und Detektion der Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe zur Erzeugung
von aussagekräftigen Zwei-Photonen-Bildern. Die Leistungsverluste
der Laserenergie im Anregungsweg und die Verluste des
Fluoreszenzsignals im Detektionsweg müssen hierfür möglichst gering
gehalten werden. Die größten Verluste im Anregungsweg gibt es durch
den Gitterkompressor, durch die Fasereinkopplung und durch die
Mikrooptik. Trotzdem ist die hier erreichte Gesamttransmission von
18% (λ0 = 800 nm) ohne Gitterkompressor vergleichbar mit der erster
Zwei-Photonen-Mikroskope. Durch Optimierung einzelner Komponenten,
vor allem des Gitterkompressors und der Mikrooptik, ist zukünftig
eine bessere Transmission möglich. Die Erzeugung von
Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignalen wird auch durch die
Pulsverbreiterung innerhalb des Faserbündels verringert. Sowohl
lineare als auch nichtlineare Effekte verbreitern spektral und
zeitlich die Pulse. Die Untersuchung dieser Effekte konnte zeigen,
dass mit Hilfe eines Gitterkompressors die zeitliche Pulsdauer am
Faserausgang bis auf ca. 10 fs wiederhergestellt werden konnte und
damit die Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung verbessert werden
konnte. Trotzdem konnten bereits bei den hier verwendeten
Leistungen (5–65 mW) auch nichtlineare Effekte beobachtet werden.
Dazu kommt, dass bei höheren Laserintensitäten keine Transmission
mehr möglich ist und die Eigenfluoreszenz der einzelnen Fasern des
Faserbündels die Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe überlagert. Zur
Beseitigung der hier gezeigten Limitierungen durch die Mikrooptik
und durch das Faserbündel sind weitere Optimierungen nötig um den
Einsatz eines Zwei-Photonen-Endoskops in vivo zu ermöglichen. Durch
den nichtlinearen Zusammenhang zwischen der Photonenintensität und
der Fluoreszenzanregung sind diese Limitierungen gravierender als
bei einer normalen Fluoreszenzanregung. Eine Reduzierung der
Spitzenintensitäten der Laserpulse bei einem gleichzeitigen Erhöhen
der Laserrepetitionsrate könnte zukünftig die nichtlinearen Effekte
reduzieren und die effektive Laserleistung am Faserausgang erhöhen.