Keimbahntransformation mit universellem Marker und neue homöotische Gene in Tribolium Castaneum

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde zum ersten Mal die
Keimbahn eines Käfers erfolgreich genetisch transformiert. Der von
uns zu diesem Zweck in Zusammenarbeit mit Ernst Wimmer entwickelte
Transformationsmarker 3xP3-EGFP hat inzwischen sein Potential als
spezies-unabhängiges Markergen auch in weiteren
Invertebraten-Spezies unter Beweis gestellt und damit das Spektrum
transformierbarer Taxa beträchtlich erweitert. In Tribolium konnten
Transformationsereignisse mit 3xP3-EGFP für drei verschiedene
Transposons - Hermes, Minos und piggyBac - erzielt werden. Die
Effizienz betrug dabei 1,4% (Hermes), 11,4% (Minos) bzw. 56%
(piggyBac) der fertilen G0 und gehört damit zu den höchsten Werten,
die in der Literatur für Insekten berichtet wurden. Bei Minos
konnte die Effizienz durch die Verwendung von Transposase mRNA
statt einem DNA Helper-Plasmid weiter auf 32,4% gesteigert werden.
Für piggyBac und Minos wurde ferner in Zusammenarbeit mit anderen
Labors gezeigt, daß es sich bei den meisten Transposoninsertionen
um unabhängige Einzelintegrationen handelt, die auf verschiedene
Chromosomen verteilt sind und stabil weitervererbt werden. Die
Größe zusätzlich transferierter Fremd-DNA kann dabei bei piggyBac
mindestens bis zu 9,5 kb betragen. Schließlich konnte noch ein
piggyBac Element durch Helperinjektion mit einer Rate von 28,1%
remobilisiert werden. Zusammen mit der Anfälligkeit für enhancer
trap Effekte können daher mit diesem System alle relevanten
Transposon-basierenden Techniken zur funktionellen Genomanalyse
angewandt werden. Als erste praktische Anwendung wurden D.
melanogaster Sequenzen für anteriore und posteriore
mRNA-Lokalisierung (bicoid-3’UTR und oskar-3’UTR), sowie ein
bicoid-abhängiger Minimalpromotor in Tribolium eingeführt.
Allerdings konnten durch diese Ansätze keine Komponenten oder
Mechanismen eines ggf. konservierten maternalen Systems
nachgewiesen werden. Ein Konstrukt mit 5,2 kb der upstream
Sequenzen von Tc’hunchback mit lacZ als Reportergen war hingegen in
der Lage, das endogene hunchback-Muster größtenteils nachzubilden.
Das frühere Ergebnis von Christian Wolff mit Tc’hunchback in
Drosophila, wonach dieses Fragment alle wesentlichen
regulatorischen Elemente enthält, konnte daher in transgenen Käfern
bestätigt werden. Zusätzlich zu dem als sehr riskant eingestuften
Transformations-Projekt wurde parallel ein weiteres Projekt
durchgeführt, die Analyse der homöotischen Mutanten wurm und
überlänge. In beiden Mutanten ist vor allem die Identität der
posterioren Segmente ab A9 verändert. In wurm sind die Segmente
A9-A11 nach A8 transformiert und die telsonalen Anhänge Urogomphi
und Pygopodien fehlen. In überlänge ist nur A9 wie A8 ausgebildet
und demzufolge nicht mit dem Telson fusioniert. Es fehlen nur die
Urogomphi. überlänge bildet zusätzlich ein ektopisches Stigma im
ersten thorakalen Segment. Es wurde gezeigt, daß es sich bei den
betroffenen Genen um zwei verschiedene Loci handelt, die beide
nicht im homöotischen Komplex liegen. Obwohl der Phänotyp von wurm
weitgehend der RNAi-Phänokopie von Abdominal-B entspricht, konnte
also keiner dieser beiden Loci einem bekannten Hox-Gen zugeordnet
werden. Als mögliches Kandidatengen für diese Loci wurde daher das
Tribolium-Homolog des regionsspezifischen homöotischen Gens spalt
kloniert. Die Expression von spalt entspricht weitgehend der von
Dm’spalt, mit einer anterioren und einer posterioren Domäne, einer
dorsalen Expression an den seitlichen Rändern des Keimstreifs,
sowie einem komplexen Muster im Nervensystem. Mit Hilfe der
kürzlich entwickelten Technik der parentalen RNAi wurde die
Funktion dieses Gens untersucht. In sal–– Phänokopien finden sich,
wie in Drosophila, anteriore und posteriore Veränderungen von
Segmentidentitäten. So wird das abdominale Segment A9 in Richtung
anteriore abdominale Segmente transformiert. Dadurch tritt ein
zusätzliches Stigma auf und die Pygopodien gehen verloren, das
Segment fusioniert aber weiterhin mit dem Telson. Im Gegensatz zu
Drosophila wird aber anterior nicht das Labium verändert, sondern
die Identität der Maxille wird partiell in Richtung Mandibel
transformiert: statt dem Enditen der Maxille wird ein
mandibel-ähnlicher Zahn gebildet. Damit kommt offenbar auch spalt
nicht als Locus in Frage, der in wurm oder überlänge seine Funktion
verloren hat. Möglicherweise spielen diese beiden Loci eine Rolle
als den HOX-Genen übergeordnete regulatorische Gene, oder als
Co-Faktor von Abd-B. Damit sind wurm und überlänge als interessante
(und aus Drosophila nicht bekannte) Spieler im homöotischen System
der Insekten identifiziert, was weitere Untersuchungen als sehr
lohnend erscheinen läßt. Vor allem aber hat dieses Teilprojekt die
Evolution des spalt-Gens erhellt, das in weniger abgeleiteten
Insekten offenbar eine essentielle Rolle bei der Spezifizierung von
Mandibel versus Maxille spielt. Diese Funktion ist in Drosophila
vermutlich im Zuge der Reduktion der Mandibel verloren gegangen.