Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Für die vorliegende Arbeit wurden 59 Ektomykorrhizen aus der Gattung Russula und drei Ektomykorrhizen aus der Gattung Lactarius morphologisch und anatomisch charakterisiert. Für die Identifizierung der Mykorrhizen wurden die DNA der Fruchtkörper und der Mykorrhizen isoliert. Mit den pilzspezifischen Primerpaaren ITS1/ITS2 und ITS1F/ITS4B wurde die ITS-Region der ribosomalen Kern-DNA mittels PCR amplifiziert. Mit vier Restriktionsenzymen wurde eine RFLP-Analyse durchgeführt. Alle Mykorrhizen ließen sich eindeutig durch den Vergleich der so erhaltenen Bandenmuster den Fruchtkörpern zuordnen. Das Enzym Taq I zeigte die größte Spezifität, mit ihm konnten auch sehr nah verwandte Arten getrennt werden. Zusammen mit den bereits in der Literatur beschriebenen Ektomykorrhizen sind damit insgesamt 56 Arten und eine Varietät aus Europa berücksichtigt. Dies entspricht ca. einem Drittel der in Mitteleuropa vorkommenden Russula-Arten. Zehn außereuropäischer Arten aus Afrika, Nord- und Südamerika ergänzen das Bild.. Die einzelnen morphologischen und anatomischen Merkmalskomplexe der Mykorrhizen und Rhizomorphen wurden ausführlich besprochen und mit denen der Fruchtkörper verglichen. Die Mykorrhizen der Schwestergattung Lactarius und weiterer Gattungen wurden ihnen gegenübergestellt. Die Mantelstrukturen der Mykorrhizen besitzen die meisten Merkmale, die sich zur Lösung systematische Fragestellungen eignen. Eine herausragende Rolle spielen hierbei die für die Russulaceae typischen gloeopleren Elemente. Sie können in den Mykorrhizen der Gattung Russula als Gloeocystiden oder als gloeoplere Zellen vorliegen. Man kann die Mykorrhizen danach in zwei Hauptgruppen einteilen: In solche die Cystiden besitzen und in solche die keine besitzen. Diese Zweiteilung entspricht aber nicht der bekannten in Compactae und Genuinae, die sich als künstlich erwiesen hat. Beiden Gruppen lassen sich noch weiter unterteilen. Mykorrhizen mit Cystiden: · Die Sektion Gossypinae, mit R. gossypina aus Madagaskar, unterscheidet sich von allen anderen Mykorrhizen der Gattung durch eine wollige Manteloberfläche. Hierin sieht sie jenen von Lactarius piperatus sehr ähnlich. · Die Mykorrhizen der Sektionen Compactae und Lactarioides besitzen Gloeocystiden, die zwei apicale Knöpfchen tragen. Sie sind dennoch voneinander zu trennen, da der Aufbau der mittleren Mantelschichten sehr verschieden ist. · Für R. fuegiana aus dem südlichen Südamerika ist aufgrund der einzigartigen Mykorrhizamäntel eine eigene Sektion “Fuegianae” zu schaffen. · Die Eigenständigkeit der Sektion Delicoarchaeae mit der Art R. aucarum (Bolivien) wird auch durch die Besonderheiten der Mykorrhizen bestätigt. · Die Sektion Heteropyllae lässt sich durch das Vorhanden sein von Nadelcystiden definieren. Ihre Subsektionen Heteropyllae, Griseinae, Ilicinae, Virescentinae, Amoeninae und Pseudoepitheliosinae (R. aff. parasitica aus Kamerun) unterscheiden sich in Form der Nadelcystiden, Vorhandensein von Gloeocystiden und Aufbau der mittleren Mantelschicht. · Auf Grund ihrer hyphenartigen Cystiden ist R. cyanoxantha aus der Sektion Heteropyllae in eine eigene Sektion Indolentes gestellt worden. · Die Sektion Ingratae zeigt eine einheitliche Flaschenform der Gloeocystiden. Die Subsektionen Foetentinae und Pectinatinae unterscheiden sich in der mittleren Mantelschicht, die Sekt. Subvelatae in zusätzlichen Nadelcystiden. · Erstmals sind mit R. acriannulata und R. aff. radicans aus West Afrika Mykorrhizen aus der Sektion Crassotunicatae, Subsekt. Aureotactinae beschrieben. Mykorrhizen ohne Cystiden: · Es können Mykorrhizenmäntel aus angulären Zellen und Mäntel aus puzzelteilartigen Zellen mit einem Hyphennetz auf der Außenseite unterschieden werden. · Die Sektion Russula - wie sie hier aufgefasst wird - ist durch anguläre Mantelzellen bestimmt. Die Mäntel der Subsektionen Russula und Atropupurinae unterscheiden sich durch ihr Zellmuster. · R. ochroleuca und R. viscida stehen mit einer eigenen Subsekt. Ochroleucinae in der Sekt. Russula. Beide besitzen ein gelbes Pigment in der Mykorrhizenausenseite, das sich mit KOH rot färbt. · R. fellea Subsekt. Felleinae gehört ebenfalls in die Sekt. Russula. · R. raoultii wird aus der Sekt. Citrinae in die Subsekt. Russula gestellt. · Alle untersuchten Arten der europäischen Sektionen Firmae, Rigidae Tenellae Insidiosinae, Viridantes, Alutaceae, Integrinae und Amethystinae besitzen Mykorrhizen mit puzzelteilartigen Mantelzellen und Hyphennetz. Sie lassen sich auf Grund der Ausprägung des Hyphennetzes und der Form der äußeren Mantelzellen zwar trennen, aber die Unterteilung ist nicht in allen Fällen so eindeutig wie in den anderen Gruppen.. · Für die südamerikanische R. nothofaginea wird die neue Sektion Nothofagineae vorgeschlagen. Die für die Gattung Russula typischen Rhizomorphen besitzen Gefäßhyphen und sogenannte leiterartige Hyphen im inneren Teil. Wenn die Mykorrhizen Cystiden tragen, ist dies auch bei den Rhizomorphen der Fall. Die Übereinstimmungen und Unterschiede dieser so erzielten Einteilung der Gattung Russula zu den bestehenden Systemen von ROMAGNESI, SINGER, BON und SARNARI wurden diskutiert. Der Vergleich mit molekulartechnisch gewonnenen Hypothesen zur Phylogenie der Gattung aus der Literatur ergab, dass diese weitestgehend mit den anatomischen Ergebnissen korrespondieren. Eine Besonderheit in der Lebensweise wurde für die beiden Mitglieder der Sekt. Firmae, Subsekt. Exalbicantinae, R. exalbicans und R. gracillima, aufgedeckt. Sie bilden zusammen mit den Arten Lactarius pubescens und L. torminosus, Subgenus Piperites, Sekt. Piperites, sogenannte Doppelmykorrhizen. Morphologisch und anatomisch gleichen diese den Mykorrhizen des jeweiligen Lactarius. Nur im Hartigschen Netz ist die Beteiligung der Russula erkennbar. Mit molekularen Methoden lässt sich die DNA beider Partner, Lactarius und Russula, in den Doppelmykorrhizen nachweisen. Ein Bestimmungsschlüssel ermöglicht die Identifizierung aller behandelten Ektomykorrhizen anhand anatomischer Merkmale auf Sektions-, Subsektions- und Artebene. Die vorgelegte Arbeit konnte exemplarisch zeigen, wie wichtig die Merkmale der Ektomykorrhizen und Rhizomorphen für die Lösung systematischer Fragestellungen sind. Bei zukünftigen Arbeiten sollten deshalb die unterirdischen Strukturen immer mitberücksichtigt werden.

Mitochondria are essential cellular organelles of eukaryotic organisms, which import most of their proteinaceous constituents from the cytoplasm. Two mitochondrial membranes contain different translocation machineries which are involved in the import and proper sorting of mitochondrial precursor proteins. The TIM22 translocase in the inner mitochondrial membrane mediates the import of polytopic proteins into this membrane. In addition to the membrane integrated components Tim22 and Tim54, the TIM22 translocase possesses components in the intermembrane space, termed Tim9 and Tim10. In the present study, the tim9 and tim10 genes of the TIM22 translocase of N. crassa were identified. The structural and functional characteristics of the corresponding gene products, the Tim9 and Tim10 proteins, were examined. Tim9 was demonstrated to be an essential protein. The Tim9 and Tim10 proteins were shown to build a 70-80 kDa heterohexameric complex in the mitochondrial intermembrane space. The isolated Tim9•Tim10 complex had the same oligomeric structure as the native one, and it proved fully functional in interacting in vitro with its physiological substrate, the ADP/ATP carrier (AAC). Peptide library screens were performed to determine the structural determinants of the substrates that are recognised by the Tim9•Tim10 complex. Efficient binding to the regions covering residues of the hydrophobic membrane spanning domains and of the connecting hydrophilic loops was observed. In this way, Tim9 and Tim10 proteins interact with their substrates, while the hydrophobic regions of the substrates are still present in the TOM complex and thereby protected from the aqueous environment of the intermembrane space compartment. Furthermore, when enclosed into proteoliposomes containing the reconstituted TOM complex, Tim9•Tim10 complex specifically promoted the translocation of the AAC precursor. Hence, the Tim9•Tim10 complex and the TOM complex are both necessary and sufficient to facilitate translocation of carrier proteins across the outer mitochondrial membrane. Finally, peptide screens and chemical cross-linking experiments were used to identify the precursor of N. crassa Tim23 protein as a novel substrate of the Tim9•Tim10 complex.

Autotrophe Bacteria sind von zentraler Bedeutung für den terrestrischen Kohlenstoffkreislauf, da sie dem an verfügbaren organischen Kohlenstoffverbindungen armen Boden Biomasse zuführen und einen Beitrag zur Reduzierung des atmosphärischen CO2 leisten könnten. Doch während die autotrophen Prozesse und die daran beteiligten Mikroorganismen in aquatischen Habitaten bereits gut untersucht und verstanden sind, besteht noch erheblicher Forschungsbedarf zur Diversität und Abundanz autotropher Bakterienpopulationen in Böden. In dieser Arbeit sollten zentrale Fragen zur Charakterisierung der autotrophen Gemeinschaften mit Werkzeugen der molekularen mikrobiellen Ökologie bearbeitet werden. Die meisten Prokaryota, die mit CO2 als einzige Kohlenstoffquelle zu wachsen vermögen, fixieren dieses über den Calvin-Benson-Bessham Zyklus. Das Schlüsselenzym dieses Zykluses ist die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO). Die große Untereinheit der Form I-RubisCO wird von dem Gen cbbL kodiert, welches phylogenetisch in zwei Hauptentwicklungslinien unterteilt wird: ‚green-like’ und ‚red-like’. Um einen Einblick in die genetische Diversität CO2-fixierender Bakterien in unterschiedlich gedüngten Agrarböden des Dauerdüngungsversuchs Ewiger Roggenbau in Halle/Saale zu erlangen, wurde eine auf PCR basierende Methodik entwickelt, die auf der Erfassung des Funktionsgens cbbL zielt. Es wurden Datenbankrecherchen durchgeführt und mittels den anschließenden vergleichenden Sequenzanalysen und phylogenetischen Untersuchungen bekannter cbbL-Sequenzen spezifische Oligonukleotid-Primerpaare konstruiert, die ausgewählte cbbL-Sequenzen terrestrischer Bakterien der ‚red-like’ bzw. der ‚green-like’ RubisCO-Linien amplifizieren. Mit Hilfe dieser Primer gelang es cbbL-Genbanken anzulegen, die mittels der Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse und Diversitätindices untersucht und verglichen wurden; ausgewählte Sequenzen wurden einer phylogenetischen Zuordnung unterzogen. Mit den entwickelten Primerpaaren konnten in den untersuchten Böden nur eine geringe Diversität an ‚green-like’ cbbL-Sequenzen festgestellt werden, die phylogenetisch zu den cbbL-Sequenzen von Nitrobacter vulgaris und Nitrobacter winogradskyi nahe verwandt waren. Im Vergleich dazu zeichneten sich die ‚red-like’ cbbL-Sequenzen aus den Böden durch eine hohe Diversität aus, wobei sie phylogenetisch über die gesamte ‚red-like’-Gruppe verteilt waren und sich häufig als nur entfernt verwandt zu bekannten cbbL-Sequenzen herausstellten. Während mit der RFLP-Analyse Bodenbehandlungs-spezifische Muster identifiziert wurden, war nach der phylogenetischen Sequenzanalyse keine Cluster-Bildung in Abhängigkeit von der Bodenbehandlung zu beobachten. Um den Datensatz an vorhandenen ‚red-like’ cbbL-Sequenzen zu erweitern, wurden cbbL-Gene aus verschiedenen kultivierten α- und β-Proteobacteria sowie aus Bakterienisolaten, die in dieser Arbeit aus Boden gewonnen wurden, amplifiziert. Die phylogenetische Sequenzanalyse gruppierte diese cbbL-Sequenzen Taxon-unabhängig zu den verschiedenen Clustern des ‚red-like’-Baums einschließlich der neuen cbbL-Gencluster aus den Halle-Böden. Bakterielle Bodenisolate, die als cbbL-positiv identifiziert wurden, konnten basierend auf ihrer 16S rDNA-Sequenz als Organismen der Gram-positiven Gattungen Bacillus, Streptomyces und Arthrobacter klassifiziert werden. Vertreter dieser bakteriellen Gruppen waren bisher nicht als CO2-Fixierer charakterisiert worden. Der physiologische Beweis eines aktiven CO2-fixierenden Metabolismus über RubisCO steht noch aus. Die Ergebnisse der ‚red-like’ cbbL-Diversitäts-Studie dienten als Grundlage zur Konstruktion weiterer Oligonukleotide, die in der „real-time“ TaqMan-PCR zur Quantifizierung von ‚red-like’ cbbL-Genen aus Boden eingesetzt wurden. Dabei wird ersichtlich, dass in den untersuchten Bodenvarianten bis zu 107 cbbL-Genkopien/g Boden enthalten sind. Die unterschiedlichen Bodenbehandlungen scheinen keinen Einfluss auf die Abundanz von ‚red-like’ cbbL-Genen in Böden zu nehmen.

[NiFe]-Hydrogenasen besitzen in ihrem aktiven Zentrum neben den namengebenden Metallen Nickel und Eisen die Nicht-Protein-Liganden CO und CN. Die Synthese und der Einbau dieses NiFe(CN)2CO Zentrums ist ein komplexer Prozess mit neuartigen bioanorganischen Fragestellungen, an dem eine Reihe von Hilfsproteinen beteiligt sind. Im Fall von Escherichia coli handelt es sich hierbei um die sieben Reifungsenzyme HypA, HypB, HypC, HypD, HypE und HypF. Zusätzlich bedarf es einer spezifischen Endopeptidase sowie ATP, GTP und Carbamoylphosphat als niedermolekulare Substrate. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ablauf der Hydrogenasereifung und der Charakterisierung der am Metalleinbau beteiligten, akzessorischen Proteinen. Im Einzelnen wurden folgende Resultate erzielt: 1. Die Funktion von HypA/HybF in vivo wurde als die eines Metallochaperons bestimmt, was einhergeht mit der Forderung nach Nickelbindung. Diese konnte experimentell nachgewiesen werden. Das Auffinden von stöchiometrischen Mengen an Zink sowie ein konserviertes Cysteinmotiv deuten auf einen “Zinkfinger“ hin, der von struktureller Bedeutung für das HybF-Protein ist. Ein Reifungsnetzwerk zwischen den drei Hydrogenasen von E. coli wurde erstellt, welches eine Regulation epistatisch zur Expression der Gene darstellt. 2. Die Charakterisierung des HypD Proteins durch Mössbauer-Spektroskopie ergab, dass es ein EPR-stilles [4Fe-4S]2+ Cluster enthält, welches ihm die gelbliche Farbe und das typische UV-VIS Spektrum verleiht. Die Bestimmung der Eisen- und Schwefelmenge im Wildtyp-Protein und in HypD-Varianten verstärkten diesen Befund. Austausche der konservierten Aminosäuren von HypD ergaben, dass ein C-terminales Cysteinmotiv zur Stabilität des Proteins beiträgt, weshalb die Cysteinreste als Liganden des FeS-Clusters vorgeschlagen wurden. 3. Da Carbamoylphosphat (CP) für die Synthese der Cyanidliganden notwendig ist, wurde ein CP-negativer E. coli Stamm näher untersucht. Dabei wurde ein Proteinkomplex aus zwei Hilfsproteinen (HypC und HypD) entdeckt, der ein Reifungsintermediat darstellt. 4. Die am HypE-Protein synthetisierte Cyanidgruppe wird auf den HypC-HypD Komplex übertragen. Dieser in vitro Befund führte zur Aufstellung eines neues Reifungsmodels als Zusammenfassung dieser Arbeit, wobei ein Gerüstkomplex zur Ligandensynthese postuliert wird.