Expression und immunmodulatorische Funktion von HLA-G und seinen verkürzten Isoformen in Tumorzellinien

Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich
in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen
Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine
Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten
Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert
werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den
extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten
Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3).
Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6
(HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die
Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander
und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle
untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen
HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen
humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen
und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung
treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von
HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von
NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig
von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren
Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens
HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und
HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist,
daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in
der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche
exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen
HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe
HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der
Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der
Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der
fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber
Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur
Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und
HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder
Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen.
Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere
Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit
TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich
weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen
Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen
HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit
Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine
Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im
Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu
finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation
mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum
funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der
Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem
peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich,
daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die
Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte.
HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der
HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine
entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der
Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert
und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei
verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von
Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in
der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi
HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten
eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist
HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach
Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m
oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da
von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der
Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von
HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi
HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren
untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere
nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd
T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten
keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der
Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren
trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der
Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der
HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die
Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.