(Bakterio-)Chlorophyll-Modifikationen zur Einlagerung in synthetische Peptide

Ziel dieser Arbeit war zum Einen die Synthese von neuartigen
(Bakterio-)Chlorophyll-Derivaten zur Einlagerung in Proteine und
ihre Charakterisierung in Lösung, zum Anderen Bindungsstudien an
Komplexen dieser Derivate mit modularen Proteinen und dem
Lichtsammler-Komplex 1 aus Rhodobacter sphaeroides. 1.) Darstellung
von Fe-(Bakterio-)Pheophytinen: Es wurde ein Verfahren etabliert,
das die Metallierung von Pheophytin a, Bakteriopheophytin a und
deren Derivate mit Eisen ermöglicht. Zusätzlich wurde diese Methode
so weit modifiziert und optimiert, dass ausgehend vom Mohrschen
Salz auch die Einlagerung von 57Fe möglich ist, wodurch eine
Erweiterung der spektroskopischen Methoden (Mößbauer-Spektroskopie)
erreicht wird. Da die Fe Komplexe nicht mit den für
(Bakterio-)Chlorophyll-Derivate etablierten Methoden gereinigt
werden können, wurde für diese Komplexe ein neues
Chromatographiesystem entwickelt. 2) Spektroskopische Untersuchung
der Fe-(Bakterio-)Pheophytine: Es ist bekannt, dass Fe-Porphyrine
leicht zu µ-oxo-Komplexen (Fe(III)(B)Phe a)2O dimerisieren und das
Zentralion in zwei Oxidationsstufen (+2 und +3) vorliegen kann. Die
Dimerisierung des Fe Phe und Fe-BPhe wurde durch
Säure-Base-Titration absorptionsspektroskopisch untersucht. In
aerober Lösung liegt das Zentralmetall des Fe-(B)Phe dreiwertig vor
((Fe(III)(B)Phe a)Cl). Dieses lässt sich „klassisch“ mit
Na-Dithionit allein durch Ligandierung mit Pyridin zum zweiwertigen
Fe(II)(B)Phe a reduzieren. Die drei Zustände der Fe-Komplexe
(Fe(III)(B)Phe a)Cl, (Fe(III)(B)Phe a)2O und Fe(II)(B)Phe a wurden
durch ESR- und Absorptionsspektroskopie charakterisiert. Die
Oxidationsstufen der drei Zustände wurden für 57Fe-Me-Pheid a durch
Mößbauerspektroskopie bestätigt. 3) Einlagerung von
Fe-Bakteriopheophytin a in LH1 von Rhodobacter sphaeroides: Zur
Untersuchung, ob Fe-BPhe von BChl-Bindungstaschen akzeptiert wird,
wurde versucht Fe-BPhe ins LH1 von Rb. sphaeroides einzulagern. Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen deuten zwar auf einen Einbau von
Fe-BPhe hin, allerdings nur in sehr geringem Maß. Zur
Quantifizierung des Fe-BPhe-Gehalts wurden verschiedene Methoden
getestet. Der einfachste und vielversprechendste Weg war die
Differenzabsorptionsspektroskopie, bei der die unterschiedliche
Absorption von µ-oxo-Dimer und Monomer des Fe-BPhe ausgenützt wird.
4) Darstellung von Formyl-(Bakterio-)Chlorophyll-Derivaten: Eine
kovalente Bindung von Chlorophyll-Derivaten an synthetische Peptide
ist durch die Kopplung von Formyl-Gruppen mit einem modifizierten
Lysin-Rest unter Bildung eines Oxims möglich. [3 Formyl]-Me-Pheid a
konnte durch oxidative Spaltung des C-3-Vinyl des Chlorophyll a mit
Ozon hergestellt werden. Ebenfalls mit Ozon konnte die
Phytyl-Doppelbindung von Pheophytin a unter Bildung des
Ethanal-Pheid a erreicht werden. Somit stehen insgesamt drei
Chlorophyll-Derivate für die kovalente Bindung an synthetische
Peptide zur Verfügung, welche die Formyl-Gruppen an verschiedenen
Positionen tragen, wodurch eine unterschiedliche Orientierung der
Pigmente im Protein erreicht werden kann. Es wurde versucht, in
Analogie zum Pheophytin a das [3-Vinyl]-Me-BPheid a mit Ozon zu
spalten. In Folge der leichten Oxidation des Makrozyklus lieferte
diese Reaktion das Zielprodukt [3-Formyl]-Me-BPheid a nur in
äußerst geringen Mengen, so dass diese Methode für die präparative
Synthese dieser Verbindung nicht geeignet ist. 5) Nicht-kovalente
Bindung von [M]-BPheid (M = Ni, Zn, Fe) in synthetische modulare
Proteine (MOP): Ni-, Zn-, und Fe-BPhe wurden auf ihre
Komplexbildung mit 216 verschiedenen, synthetischen
Vier-Helix-Bündel-Proteinen untersucht. Die [M] BPheid-MOP-Komplexe
wurden absorptionsspektroskopisch auf die Stärke der Bindung, die
Koordination des Zentralmetalls und auf die Hydrophobizität der
Umgebung untersucht. Alle MOP binden [M] BPheid in sehr
unterschiedlichem Maße. Stärke und Art der Bindung werden in erster
Linie durch die Bindehelix bestimmt. Eine quantitative Modulation
findet allerdings auch durch die Abschirmhelix statt. Ni-BPheid
zeigt in den Komplexen drei mögliche Koordinationszustände (nc = 4,
5, 6). Eine hohe Koordinationszahl geht immer mit einer stabilen
Bindung und einer schmalen Qy Bande einher. Zn-BPheid ist in allen
Komplexen fünffach koordiniert, das Fe-BPheid vierfach. Qualitativ
zeigen alle drei Pigmente ein gleiches Muster in Bezug auf das
Bindungsverhalten, so dass ausgehend von Häm-Bindungstaschen die
Bildung von BChl-Bindungstaschen bestätigt werden konnte.