Funktionelle und genetische Analyse des Latenten Membranproteins 1 des Epstein-Barr Virus

Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen
und induziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der
B-Zell-Immortalisation ist ein Modellsystem, das die
pathogenetischen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt.
In vitro gilt das virale latente Membranprotein 1 (LMP1) für die
Immortalisation von B-Zellen als essentiell. LMP1 ist ein
integrales Membranprotein, das als konstitutiv aktivierter
Pseudorezeptor verschiedene Signalwege in der B-Zelle induziert und
dabei analoge Funktionen zum zellulären CD40-Rezeptor wahrnimmt.
Das Genom des EBV ist in dem Maxi-EBV-System einer genetischen
Manipulation zugänglich. Zuerst habe ich verschiedene Mutanten des
LMP1 Gens im Kontext des EBVGenoms etabliert und auf ihren Phänotyp
untersucht. Überraschenderweise war es möglich, mit allen LMP1
mutierten EBVs proliferierende B-Zellklone zu generieren, dies
gelang sogar mit einer „knock out“ Mutante des kompletten LMP1
Gens. Die zehn verschiedenen LMP1- Mutanten unterschieden sich
gravierend in ihrer Effizienz, B-Zellen zu immortalisieren. So
wurden bis zu 100 mal mehr Virionen benötigt, um z.B. mit der
LMP1-„knock out“-Mutante proliferierende B-Zellklone zu etablieren.
Eine solche B-Zelllinie wies in einem in vivo Experiment mit
SCID-Mäusen im Gegensatz zu B-Zelllinien mit Wildtypvirus kein
onkogenes Potential auf. Im Widerspruch zu den bisherigen
Veröffentlichungen einer anderen Gruppe zeigen meine Ergebnisse,
dass LMP1 für den Prozess der B-Zell-Immortalisation in vitro zwar
kritisch, aber nicht zwingend notwendig ist. Für die Onkogenität
von EBV in vivo ist LMP1 dagegen absolut essentiell. Die Zielgene
des LMP1, die die verschiedenen Effekte wie B-Zell-Immortalisation,
Onkogenität und Tumorentstehung vermitteln, sind nicht vollständig
bekannt. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war deshalb die umfassende
Katalogisierung dieser Zielgene. Da LMP1 und der CD40-Rezeptor
analoge Funktionen und gemeinsame Signalmediatoren und -wege
aufweisen, sollten vergleichende Untersuchungen von LMP1- und
CD40-regulierten Genen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde
ein konditionales LMP1-System in humanen B-Zellen etabliert, das es
erlaubt, LMP1-Signaltransduktion innerhalb eines sehr kurzen,
definierten Zeitraums zu induzieren und differentiell exprimierte
Gene zu identifizieren. Da der CD40-Rezeptor auf humanen B-Zellen
konstitutiv exprimiert ist und durch Interaktion mit seinem
Liganden aktiviert werden kann, konnte die Analyse CD40-regulierter
Zielgene im selben Zellsystem erfolgen. Unter Anwendung von ATLAS
Array-Filtern und Affymetrix Chips wurden 144 LMP1- und 28
CD40-regulierte Gene identifiziert. Schließlich konnte in
Zellzyklusanalysen gezeigt werden, dass LMP1-Signale in humanen
B-Zellen echte proliferative Effekte vermitteln und nicht nur
anti-apoptotische Funktionen erfüllen.