Die Bradykinin B1 und B2 Rezeptoren als Modell für die Untersuchung der Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet
die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien.
Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen
(patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren
GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch
G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven
G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach
Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über
Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse
z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs
strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur
Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche
bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören
zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und
werden durch die pro-inflammatorischen Peptide
desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin
(BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten
B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert
wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter
pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine.
Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern
verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an
Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische
Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen
activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders
im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre
Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes
Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren
Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide
Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine
Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine
und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt
es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β)
und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische
Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter
anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine
häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des
bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter
Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf
Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene
bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres
Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische
Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am
Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke
der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine
Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann.
Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des
Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen
Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung
von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C;
normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig
davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die
gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C
konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische
Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung
zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter
pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet
darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte
Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder
-abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem
Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch
die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus
ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs
wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die
E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder
die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert.
Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin
durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6),
auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der
B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an
Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur
Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic
lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend
untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente
G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der
vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle
Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und
G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle
eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige
Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen
Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch
nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals
gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu
Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht
zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar
ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf
unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der
G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der
Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“
durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte
ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im
Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine
konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell
als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert.
Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe,
dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit
unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die
G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der
Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine]
auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch
konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte
wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch
normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt
somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in
einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse
der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann.
Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere
aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten
gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder
Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch
differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der
unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination
mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small
molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren
signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre
möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten,
die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte
therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich.