Nachweis disseminierter Tumorzellen operabler gastrointestinaler Tumoren mittels quantitativer RT-PCR von Melanom Antigen (MAGE) - A - Transkripten

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch
nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der
Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich
hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem
frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln,
anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“
fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die
Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des
Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen
unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit
bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu
identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt,
ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits
erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und
Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem
Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen
Zugang zu ermöglichen. Hierfür entwickelten wir eine quantitative
Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die
hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische
Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die
Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen
Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen,
adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der
Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der
MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere
Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen
A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten
wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der
Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml
zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT
29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14
Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet.
Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und
postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen
gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene
Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten
Tumorzellen. Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das
Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das
Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern
zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht
einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in
107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten
Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert.
Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei
10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung
nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen
erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich
keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung
(pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading
(G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten. Ob und in
welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise
Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor
abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten
einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen
Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand
weiterer Forschungsarbeiten sein. Hierfür haben wir ein
hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis
disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es
gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten
Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so
das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.