Vergleichende Analyse des Proteoms der Bursa Fabricii des Huhns zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, molekulare Vorgänge
während der B-Zellentwicklung in der Bursa Fabricii des Haushuhns
mittels proteomischer Analysen zu charakterisieren. Hierfür wurden
zunächst repräsentative Zeitpunkte der bursalen B-Zellentwicklung
für die Probengewinnung definiert. Daran schlossen sich qualitative
Proteomanalysen der Bursa Fabricii zu den gewählten
Entwicklungszeitpunkten Embryonaltag 10 (ET10), Embryonaltag 18
(ET18), Tag 2 und Tag 28 nach dem Schlupf an. Diese erfolgten durch
Vorfraktionierung der Proben mittels 1D-SDS-PAGE und nano-HPLC
gefolgt von Tandem-MS-Analysen. Hierbei konnten für die bursalen
Proteome zu jedem Zeitpunkt zwischen 1152 und 1392 Proteine
identifiziert werden (FDR < 1 %). Überschneidungen der einzelnen
Zeitpunkte in 537 allgemeinen Struktur- und Stoffwechsel-Proteinen
berücksichtigt, wurden insgesamt 2214 verschiedene Proteine
identifiziert. Eine zusätzliche qualitative Analyse aufgereinigter
bursaler B-Zellen führte zur Identifizierung von 758 Proteinen.
Durch genontologische Analysen konnte festgestellt werden, dass für
das Zellwachstum verantwortliche Proteine va. zu den frühen
Zeitpunkten zu finden waren, während Proteine, welche eine Rolle
für das Immunsystem spielen, eher zu späteren
Entwicklungszeitpunkten in Erscheinung traten. Dies spiegelt die
Entwicklung der Bursa von der unreifen, embryonalen Wachstums- und
Differenzierungsprozessen unterliegenden Bursaanlage, zum fertig
ausdifferenzierten, primär-lymphatischen Organ auf molekularer
Ebene wider. Konform zu den hohen Proliferationsraten der B-Zellen
während der Bursaentwicklung fanden sich in den genontologischen
Analysen der B-Zellen besonders hohe Anteile an Proteinen, welche
für Zellteilung verantwortlich sind. Proteine, welche in
Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden vor allem in der
B-Zell-Probe sowie an ET10 gefunden, was als Hinweis auf eine
Beteiligung dieser Proteine an der Einwanderung der B-Zellen in die
Bursaanlage betrachtet werden kann. Die anschließende quantitative
Proteomanalyse wurde zu denselben Entwicklungszeitpunkten an je
sechs biologischen Replikaten mittels 2D-DIGE durchgeführt. In der
statistischen Auswertung der quantitativen Veränderungen zeigten
sich 402 hochsignifikante Unterschiede zwischen den bursalen
Proteomen der verschiedenen Entwicklungszeitpunkte, wobei die sehr
große Übereinstimmung der Analyseergebnisse innerhalb der
biologischen Replikate die gute Reproduzierbarkeit der Experimente
belegte. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich zwischen ET10
und allen weiteren Zeitpunkten, wohingegen innerhalb der übrigen
Stadien eine geringere Anzahl signifikanter Unterschiede
nachgewiesen wurde. Für die 402 differentiell exprimierten Proteine
konnten verschiedene charakteristische Protein-expressionsverläufe
nachgewiesen werden, welche Rückschlüsse auf die biologischen
Hintergründe ermöglichten. Durch massenspektrometrische Analysen
der Proteine mittels MALDI-TOF/TOF und LC-MS/MS gelang es, 203 der
242 zur Identifikation vorgesehenen Spots zu identifizieren. Im
Rahmen einer bioinformatischen Auswertung des erhaltenen
Datensatzes erbrachten sowohl die genontologische Analysen als auch
Pathway-Analysen wesentliche Anhaltspunkte für die Auswahl
besonders interessanter und vielversprechender Proteine für
weiterführende funktionelle Analysen. Unter den identifizierten,
differentiell exprimierten Proteinen fanden sich auffällig viele
Vertreter des Aktin-Zytoskelett-Pathways, welcher für die
mechanische Stabilisierung von Zellen und deren aktive Bewegungen
verantwortlich ist. Dabei fielen in dieser Arbeit sowohl Vinculin
als auch Gelsolin durch ihre charakteristischen Expressionsmuster
auf. Vinculin zeigte zu Beginn der embryonalen Entwicklung erhöhte
Abundanzwerte, welche nach ET18 steil abfielen. Als fokales
Adhäsionsprotein stellt es ein Schlüsselprotein in der Regulation
der Übertragung von kontraktilen Kräften dar, welche die
Voraussetzung für die Migration von Zellen sind. Gelsolin, ein
wichtiges Apoptose-Effektorprotein, welches auch in Verbindung mit
Zellmotilität gebracht wird, zeigte erhöhte Expressionslevel an
ET18, welche über die nachfolgenden Entwicklungszeitpunkte
abfielen. Gelsolin konnte in drei verschiedenen Ladungs-Isoformen
detektiert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit interessant
erschien weiterhin eine Gruppe differentiell exprimierter Proteine
des Retinolsäure-Metabolismus. Im Einzelnen wurden die
Retinaldehydrogenase 2 (ALDH1A2), das „retinol-binding protein 5“
(RBP5), das „fatty acid-binding protein 7“ (FABP7), und
Transthyretin (TTR) mit ähnlichen Proteinexpressions-profilen
detektiert, welche ihr Expressionsmaximum jeweils an ET10
aufwiesen. Das könnte ein Hinweis sein, dass die embryonale
Entwicklung der Bursa Fabricii von ähnlichen Faktoren gesteuert ist
wie die embryonale Ausbildung der sekundär-lymphatischen Organe
beim Säuger, bei der Retinolsäure-abhängige Proteine eine
entscheidende Rolle spielen. Über die Thematik dieser Arbeit
hinausgehend, stellt der umfangreiche proteomische Datensatz dieser
Arbeit eine wertvolle Ressource dar, die sowohl für weitere
Fragestellungen bezüglich der Bursa Fabricii des Huhns, als auch
für die Vervollständigung der Annotation des Hühnergenoms genutzt
werden können.