Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv
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Sound localization and recognition are two important tasks of the auditory system. Both require accurate processing of temporal cues. Microsecond differences in the arrival time of a sound at the two ears (interaural time differences, ITDs) are the main cue for localizing low frequency sound sources in space. Traditionally, ITDs are thought to be encoded by an array of coincidence-detector neurons, receiving excitatory inputs from the two ears via axons of variable length (“delay lines”), aligned in a topographic map of azimuthal auditory space. Convincing evidence for the existence of such a map in the mammalian ITD detector, the medial superior olive (MSO) is, however, lacking. Equally undetermined is the role of a temporally glycinergic inhibitory input to MSO neurons. Using in vivo recordings from the MSO of the Mongolian gerbil, the present study showed that the responses of ITD-sensitive neurons are inconsistent with the idea of a topographic map of auditory space. Moreover, whereas the maxima of ITD functions were found to be outside, the steepest slope was positioned in the physiologically encountered range of ITDs. Local iontophoretic application of glycine and its antagonist strychnine revealed that precisely-timed glycinergic inhibition plays a critical role in determining the mechanism of ITD tuning, by shifting the slope into the physiological range of ITDs. Natural sounds are modulated in frequency and amplitude and their recognition depends on the analysis of, amongst others, temporal cues. The bat MSO has been shown to be involved in filtering of sinusoidally amplitude modulated (SAM) sounds. This observation led to the assumption that the MSO serves different functions in high and low frequency hearing mammals, namely filtering of temporal cues in high and sound localization in low frequency hearing animals. However, the response to temporally structured sounds has only rarely been investigated in low frequency hearing animals. This study showed that MSO neurons in the gerbil (a rodent that uses ITDs for sound localization) exhibit filter properties in response to the temporal structure of SAM sounds. These results provide evidence for the fact that the MSO in low frequency hearing animals cannot only be linked to temporal processing of spatial cues, but has additional temporal functions. Auditory information is processed in a number of parallel paths in the ascending auditory pathway. At the brainstem level, several structures are involved, which are known to serve different well-defined functions. However, the function of one prominent brainstem nucleus, the rodent superior paraolivary nucleus (SPN) is unknown. Two hypotheses have been tested using extracellular single cell physiology in the gerbil. The existence of binaural inputs indicates that the SPN might be involved in sound localization. Although almost half of the neurons exhibited binaural interactions (most of them excited from both ears), effects of ITDs and interaural intensity differences were weak and ambiguous. Thus, a straightforward function of SPN in sound localization appears to be unlikely. Inputs from octopus and multipolar/stellate cells of the cochlear nucleus, and from principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body, could relate to precise temporal processing in the SPN. Based on discharge types, two subpopulations of SPN cells were observed: sustained discharges and phasic ON or OFF responses. The temporal precision of ON responders in response to pure tones and SAM was significantly higher than that in sustained responders. The existence of at least two subpopulations of neurons (ON and sustained responders) is in line with different subsets of SPN cells that can be distinguished morphologically and may point to them having different roles in the processing of temporal sound features.
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Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivität verschiedener Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) reguliert. Die zelluläre Menge des CDK-Inhibitorproteins p27Kip1 spielt eine entscheidende Rolle beim Übergang der Zelle von der G1- zur SPhase. Die Menge von p27Kip1 steigt während der G0- oder der G1-Phase an und nimmt zu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von p27Kip1 an die CDKKomplexe der G1-Phase inaktiviert diese und verhindert dadurch die Initiation der SPhase. Eine verminderte Menge von p27Kip1 am G1/S-Phaseübergang findet man dagegen häufig in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zelluläre Menge des Inhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und einem aggressiven Verlauf der Erkrankung verbunden. Die zelluläre Aktivität und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine reguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden deshalb mit Hilfe von rekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des Inhibitors in HeLa-Zellextrakt identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2 ist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion zwischen p27Kip1 und Grb2 könnte damit, nach Stimulation der Zelle durch verschiedene Mitogene, die Signalweitergabe mit der Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion notwendige Domäne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine acht Aminosäuren lange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf der anderen Seite interagiert Grb2 vornehmlich über seine C-terminale SH3-Domäne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1 nah verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren dagegen nicht mit Grb2. In einer erweiterten Analyse wurden 41 verschiedene rekombinante SH3-Domänen auf eine Interaktion mit p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 nur mit der C-terminalen SH3-Domäne von Grf40/Mona und der SH3-Domäne der Tyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase Lyn in vivo führte zur Hypothese, daß p27Kip1 durch Lyn phosphoryliert werden könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht. In Phosphoaminosäureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte gezeigt werden, daß p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Diese Zusammenfassung 13 Phosphorylierung konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und verschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin 88 und 89 eingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des trimeren Komplexes aus p27Kip1, CDK2 und Cyclin A kommt der Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der Kinase zu liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit eine Phosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einfluß auf die Aktivität des Inhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 verhindert nicht die Bindung an den CDK-Komplex. Allerdings konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt werden, daß eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der Aktivität des Inhibitors führt. Diese Ergebnis konnte in vivo bestätigt werden. Interessanterweise verstärkt die Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex. Die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein initiales Signal zum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das so markierte p27Kip1 wird von einem E3-Ligase-Komplex erkannt und ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In Halbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von p27Kip1 und einer Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1 konnte zeigten werden, daß beide Formen, im Vergleich zu unverändertem p27Kip1, eine höhere Stabilität aufweisen. Die Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die Inaktivierung des Inhibitors durch die Phosphorylierung von Tyrosinresten zeigt eine Möglichkeit auf wie p27Kip1, in Abhängigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in dieser Arbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit p27Kip1 verbindet damit die Signaltransduktion mit der Zellzykluskontrolle.
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Modified Vaccinia Virus Ankara is a highly attenuated vaccinia virus strain developed during the smallpox eradication campaign. Nowadays recombinant attenuated poxviruses gain importance as live carrier vaccines against different infectious diseases and in cancer therapy. The aim of this work was to develop recombinant viral vectors, for presentation of a foreign antigen on the surface of extracellular enveloped particles (EEV). First, it was tested whether significant amounts of this viral form are produced by MVA in comparison to replication competent and widely used vaccinia virus strains. Using a number of independent approaches it could be shown that MVA infection in primary chicken embryo fibroblasts results in the production of enveloped viruses, but strikingly most of these were not released into the culture medium but remained attached to the plasma membrane. The results also showed that the replication competent vaccinia virus IHD-J is more efficient in trans-Golgi-network-wrapping and in releasing enveloped virions into the extracellular medium, while the WR strain is less efficient than MVA. Two different strategies were followed to target the recombinant protein to the surface of extracellular enveloped viruses. Since it was shown that non-vaccinia virus proteins can be incorporated to some extent into the outer membrane, a native model type II membrane protein was used. To increase the chance of foreign protein incorporation a fusion protein was used which consisted of the transmembrane domain of a protein known to be specific for the outer membrane of extracellular eveloped virus and the extracellular domain of the foreign antigen which was used in its native form. The data show that both proteins were incorporated into the extracellular enveloped virions produced in MVA infected chicken embryo fibroblasts, albeit with low efficiency. the ransmembrane domain of the EEV pecific protein was not sufficient to target the foreign protein specifically to the outer envelope.
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The genetic engineering of higher plant chloroplasts typically involves the stable integration of antibiotic resistance genes as dominant selectable markers. The potential spread of these genes through pollen release or to soil microbes via horizontal gene transfer is of considerable environmental concern. The use of chloroplast transformation alleviates the first of these problems to some degree since plastid-encoded genes are maternally inherited in most important crop species. However, the complete removal of antibiotic resistance genes from transplastomic plants is preferable for improved safety standards. In this work a new system was established for the production of marker-free chloroplast transformants using the approach of pigment mutant reconstitution in combination with a novel transformation vector. The complementation of a plastid mutant was shown to be an efficient and rapid system for the generation of plastid transformants supported by the phenotype-assisted selection and the restoration of photosynthesis. Furthermore, new results regarding the recombination process between standard transformation vectors and the plastid genome led to the idea to clone the antibiotic resistance gene outside and not between the homologous flanks used for stable gene introduction. In this configuration the selection marker can never become stably integrated into the plastome and gets simply lost once the antibiotic selection pressure is removed. Phenotype-assisted selection of plastid transformants in combination with a transient selection marker is a new efficient system for the rapid production of marker-free plastid transformants in the first generation.
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Meiosis is a special form of cell division which results in the formation of haploid cells. At the end of meiosis in yeast four new cells, the so-called spores, are formed inside the boundaries of the mother cell. This morphogenetic process requires de novo formation of the cell membranes. Surprisingly it is the spindle pole bodies (SPBs) which organize the formation of these prospore membranes (PSMs). Membrane vesicles, probably redirected from the secretory pathway, accumulate at the cytoplasmic face of the SPB and fuse to form a continuous membrane system. In our lab we have identified a protein complex which localizes to the tip of this growing membrane, the leading edge protein coat (LEP coat). In this thesis I demonstrate that the S. cereviaiae protein Ssp1p is a novel component of the LEP coat. It is even the most important constituent of the LEP coat as it recruits all other components to this structure. I can show here that Ssp1p is a lipid binding protein and this affinity is probably required for anchoring the protein complex in the membrane. Ssp1p would then act like a hinge, connecting the PSM to Ady3p, another protein of the LEP coat. Deletion of SSP1 results in a block of sporulation. Here I show that this is most probably due to a defect in membrane shaping. In the deletion mutant the PSM sticks very tightly to the nuclear envelope and closes without incorporating cytoplasm. This later on leads to a defect in spore formation and to a loss of viability. One possible explanation for this phenotype would be that the LEP coat serves as a scaffold which provides some structural stability to the membrane while it grows. The protein ring at its tip might also keep the membrane open until all constituents required are enclosed. In addition to its lipid binding activity it is demonstrated that Ssp1p localizes to the plasma membrane of the bud when it is overexpressed in mitotic cells. This is a hint that Ssp1p might be involved in membrane vesicle targeting. Ssp1p could either be directed to target membranes by their lipid composition or by other interacting proteins. As overexpression of Ssp1p in mitotic cells is toxic some interference with the secretory pathway machinery is proposed.
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Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Vorraussetzung für eine erfolgreiche Infektion sind Fusion zweier kompatibler, haploider Zellen und die folgende Ausbildung eines dikaryotischen Filaments. Diese Prozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der a-Locus kodiert für ein biallelisches Pheromon/Pheromonrezeptor-System, das die Zell/Zell-Erkennung und die Zellfusion reguliert. Die folgende pathogene Entwicklung wird durch den multiallelischen b-Locus kontrolliert, der für zwei Homeodomänenproteine kodiert, bW und bE. Nach der Fusion der haploiden Sporidien können sich bE/bW-Heterodimere ausschließlich aus bW und bE-Proteinen unterschiedlicher Allele bilden. Diese regulieren das filamentöse Wachstum, die Penetration der Pflanzenoberfläche, das Wachstum in der Pflanze und die Tumorinduktion. Das Ziel dieser Arbeit war es, regulatorische Gene aus U.maydis zu identifizieren, die an der Kontrolle der b-abhängigen, pathogenen Entwicklung beteiligt sind. Es wurde versucht, in einem direkten Selektionsprozess haploide, pathogene Stämme zu isolieren, die aus einer REMI-Mutagenese hervorgingen. Um eine möglichst breite Mutagenese zu erreichen, wurde eine neuartige Mutagenesestrategie angewandt, die neben Geninaktivierung ("loss of function") auch eine mögliche Aktivierung der Genexpression der betroffenen Loci ("gain of function") berücksichtigte. In einer weiteren UV-Mutagenese wurden durch Nutzung von egl1 als Reportergen Stämme isoliert, die EG-Aktivität zeigten. Die Expression des b-abhängigen, aber vermutlich nicht direkt durch das bE/bW-Heterodimer regulierten Gens egl1 sollte dabei eine Mutation in einem regulatorischen Gen anzeigen, das wiederum unter der Kontrolle von b stehen könnte. Es wurde angenommen, dass die interessantesten Stämme neben egl1 weitere b-abhängige Gene exprimieren. Eine komplexe Deregulation der Genexpression b-abhängiger Gene in haploiden Zellen sollte die Zentralität des betroffenen Regulators innerhalb der b-Regulationskaskade anzeigen. Die Komplementation des Stammes MR9-1 führte zur Isolierung eines regulatorischen Gens. hda1 kodiert für ein Protein mit signifikanter Homologie zu Histondeacetylasen und ist an der Kontrolle der differentiellen Genexpression in haploiden und dikaryotischen Zellen, und später an der Sporenentwicklung im Tumor entscheidend beteiligt. Hda1 wirkt in haploiden Zellen nicht als genereller Regulator der Genexpression, sondern bestimmt ein spezifisches Set von hda1-abhängigen Genen, das sich vornehmlich aus b-abhängigen Genen und den b-Genen selbst zusammensetzt. Haploide ∆hda1-Stämme vollziehen nicht die pathogene Entwicklung; nur dikaryotische ∆hda1-Zellen führen zur Tumorentwicklung, leiten jedoch nicht die Bildung von Sporen im Tumorgewebe ein. Funktionelle und biochemische Analysen zeigen in haploiden Zellen einen hochmolekularen Hda1-Komplex, der vermutlich den Aufbau einer höher geordneten Chromatinstruktur an regulatorischen Sequenzen bestimmt. Vermutlich kann Hda1 über einen Deacetylierungsmechanismus regulatorischer Sequenzen zur Repression b-abhängiger Gene führen.
Isolation und molekulare Charakterisierung des Apoptose-induzierenden Metastasensuppressors C33/CD82
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Die Apoptose ist ein genetisch codiertes Suizidprogramm, das es jeder eukaryontischen Zelle erlaubt, auf bestimmte endogene oder äußere Signale mit einem kontrollierten Degradations- und Absterbeprozess zu reagieren. Auf diese Weise werden dem Organismus überzählige oder geschädigte Zellen entzogen, ein Prozess, der z.B. bei Krankheiten wie Krebs zumindest partiell ausser Kraft gesetzt ist. Um neue Einblicke in das erst in Teilen aufgedeckte Netzwerk Apoptose-induzierender Gene zu erhalten, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Expressions-Screeningverfahren zur Identifikation neuer proapoptotischer Gene eingesetzt. Mit diesem Verfahren, das auf der Fähigkeit der Gene dominant Apoptose zu induzieren basiert, wurden mehr als 50 neue Apoptose-induzierende Gene isoliert, von denen einige Ursache bestimmter Krankheiten sein könnten. Aus diesen wurde das Metastasensuppressorgen C33/CD82 für weitere Untersuchungen ausgewählt, da seine Expression in zahlreichen stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist und es bislang nicht als proapoptotisch beschrieben wurde, obwohl es eines der bislang bestcharakterisiertesten Metastasensuppressorgene ist und die Apoptose ein kritischer Faktor bei der Metastasierung ist. C33/CD82-Apoptose erfolgt durch Aktivierung der Mitochondrien. Dadurch kommt es zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung proapoptotischer Faktoren in das Cytoplasma, wo diese Caspasen aktivieren, sodass es zur Ausprägung charakteristischer Merkmale der Apoptose kommt: neben morphologischen Veränderungen, wie der Ausbildung apoptotischer Körperchen, wird Phosphatidylserin exponiert und die DNA und bestimmte Proteine werden degradiert. Ausgelöst wird die C33/CD82-Apoptose durch Superoxidanionen, die anders als bei Standard-Apoptosewegen nicht an der mitochondrialen Elektronentransportkette gebildet werden. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass auch einige andere Mitglieder der Tetraspanin-Superfamilie, der C33/CD82 angehört, Apoptose induzieren: hierzu zählen CD9, CD37, CD81 und CD151 und in geringerem Umfang auch CD53 und CD63. Mit Hilfe trunkierter Mutanten wurde der für die Apoptoseinduktion verantwortliche Bereich auf die ersten 119 Aminosäuren von C33/CD82 eingegrenzt. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit ist die C33/CD82-Apoptose eine wesentliche neue Eigenschaft des Proteins: Sie könnte neben der Beeinflussung der Zellmotilität, die durch E-Cadherin und Integrine vermittelt wird, mit denen C33/CD82 interagiert, und der Internalisierung des EGF-Rezeptors, die durch C33/CD82 beschleunigt wird, zur Wirkung des Proteins als Metastasensuppressor beitragen. Die Überexpression von C33/CD82 induziert nicht nur Apoptose in allen getesteten Tumorzelllinien, sondern auch unter hypoxischen Bedingungen. In vivo sind derartige Bedingungen im Inneren nicht vaskularisierter Tumore und Metastasen zu finden. Dort könnten sie, bedingt durch die Hypoxie-aktivierbaren Transkriptionsfaktoren p53 und NFIL6, zu einer Verstärkung der C33/CD82-Expression führen. Die Vermeidung von Hypoxie-induzierter C33/CD82-Apoptose könnte ein Grund dafür sein, dass die Expression von C33/CD82 in vielen untersuchten stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist. Eine Besonderheit von C33/CD82 ist, dass nicht nur seine Überexpression dominant Apoptose induziert, sondern dass bereits das normale Expressionsniveau Zellen für wenigstens einen spezifischen proapoptotischen Stimulus sensitiviert. Im Fall dieser Arbeit war dies Cycloheximid, welches stellvertretend für weitere applizierbare und möglicherweise therapeutisch verwendbare Stimuli stehen könnte. Vielleicht existiert auch ein Cycloheximid entsprechender endogener Stimulus, der wie Cycloheximid ausschließlich in C33/CD82-positiven Zellen Apoptose auslöst. Die in dieser Arbeit entdeckten Fähigkeiten von C33/CD82, dominant Apoptose zu induzieren und Zellen für Apoptoseinduktion zu sensitivieren, sind neue Eigenschaften des Metastasensuppressors C33/CD82, die zu der in vivo beobachteten, in der Literatur vielfach beschriebenen Metastasensuppression beitragen können.
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In traditionellen Klassifikationssystemen der Angiospermen (Bedecktsamer) werden die Ordnungen der Caryophyllales, Polygonales und Plumbaginales und Polygonales in die Unterklasse Caryophyllidae eingeordnet. Obwohl der Verwandtschaftskreis mehrmals Gegenstand verschiedener Studien war, ist die Abgrenzung der Caryophyllidae und der neuerdings zu ihnen gez?xE4;hlten carnivoren Taxa nach wie vor unsicher. In dieser Arbeit wurde durch vergleichende Sequenzanalysen verschiedener Genorte eine Phylogenie der carnivoren Nepenthaceae und der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae aufgestellt. F?xFC;r die Ancistrocladaceae wurde ein taxonomisches Konzept f?xFC;r den in SO-Asien weitverbreiteten A. tectorius-Komplex erstellt. Als phylogenetische Marker wurden das trnK-Intron der Chloroplasten-DNA und die Internal-Transcribed-Spacer (ITS-Region) der nukle?xE4;ren rDNA eingesetzt. Bei den Nepenthaceae kam es zur Koamplifikation von rDNA-Pseudogenen. Die kladistische Analyse dieser Pseudogene legt die Annahme nahe, dass sich die rezenten Nepenthaceae aus einemVorfahren entwickelten, der bereits verschiedene ITS-Sequenzen aufwies. Auch f?xFC;r das trnK-Intron der Nepenthaceae wurden zwei paraloge Sequenzen identifiziert. Durch den Einsatz einzelner Chloroplasten als Template in der PCR und inverser PCR wurde die Lokalisation eines Paralogons im Chloroplasten nachgewiesen und Hinweise auf die Lokalisation des zweiten Paralogons im Miotchondrium gewonnen. Die mitochondriale Kopie des trnK, die aufgrund der h?xE4;ufigen Unterbrechung des Leserasters im f?xFC;r die Maturase K kodierenden Bereich des trnK-Introns (matK) ein Pseudogen darstellt, wurde als zus?xE4;tzlicher phylogenetischer Marker f?xFC;r die Nepenthaceae vergleichend sequenziert, eignete sich aber nur eingeschr?xE4;nkt zur phylogenetischen Rekonstruktion. Es konnte gezeigt werden, dass die hohe Variabilit?xE4;t des Genorts wahrscheinlich durch Heteroplasmie und lineage sorting entstand und nicht auf homologe Substitutionen zur?xFC;ckgef?xFC;hrt werden kann. Dies steht jedoch im Widerspruch zu verf?xFC;gbaren Daten in der Literatur. Durch kladistische Analyse des im trnK-Intron lokalisierten matK an ausgew?xE4;hlten Taxa konnte gezeigt werden, dass innerhalb der Caryophyllidae die Droseraceae, Drosophyllaceae, Nepenthaceae, Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae eine Monophylie bilden. Die Carnivorie ist demnach innerhalb der Caryophyllidae monophyletisch entstanden und bei den Ancistrocladaceae sowie einigen Gattungen der Dioncophyllaceae (Habropetalum und Dioncophyllum) sekund?xE4;r verloren gegangen. Die trnK-Intron-Phylogenie der Nepenthaceae zeigt in hohem Ma?xDF;e eine Korrelation mit der Biogeographie. Aufgrund dieser Beziehung l?xE4;?xDF;t sich ein Szenario der Besiedelung des malaiischen Archipels durch die Nepenthaceae ableiten. Die Hypothese, die Nepenthaceae h?xE4;tten aufgrund des Vorkommens von zwei relikt?xE4;ren Taxa auf Madagaskar einen Ursprung in Gondwana, kann durch die trnK-Intron-Phylogenie nicht gest?xFC;tzt werden. Die Sequenz- und Fingerprintanalysen zeigten, dass die Variabilit?xE4;t der Ancistrocladaceae S?xFC;dostasiens mit der afrikanischer Arten vergleichbar ist. Die Inkongruenz von trnK-Intron und ITS-Phylogenie, sowie eine scheinbar erh?xF6;hte Mutationsrate des trnK-Introns legen den Schlu?xDF; nahe, dass bei der Artbildung der Ancistrocladaceae vor allen in S?xFC;dostasien Hybridisierungen und Introgressionen eine gro?xDF;e Rolle gespielt haben. Durch Vergleich der Sequenzdaten mit ISSR- Fingerprints (Inter-Simple-Sequence-Repeat-PCR) konnten die im Rahmen mehrerer Sammelreisen aus S?xFC;dostasien beschafften Proben zahlreicher Populationen in zehn unterscheidbare Taxa eingeteilt werden. Von diesen wurden drei aufgrund von ITS-Sequenzen, die aus Isotypusmaterial gewonnenen wurden, den g?xFC;ltig beschriebenen Arten A. pinangianus, A. attenuatus und A. cochinchinensis zugeordnet. Inwieweit die verbliebenen Taxa neu beschrieben werden k?xF6;nnen, m?xFC;ssen morphologische Untersuchungen zeigen.
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Bovine respiratory syncytial virus (BRSV), family Paramyxoviridae, subfamily Pneumovirinae, is a major etiological agent of respiratory tract disease in calves. A peculiarity of pneumoviruses is the presence of two unique nonstructural protein genes, NS1 and NS2. We show that both BRSV NS proteins are necessary and sufficient to mediate IFN resistance. This function can also be transferred to another, unrelated virus, Rabies virus. The mechanism of IFN resistance is conserved among the Pneumovirinae since the NS proteins of human RSV (HRSV) and of Pneumoniavirus of Mice (PVM) are also able to mediate IFN resistance in a similar manner. Furthermore, both BRSV NS proteins are able to block the induction of IFN by inhibiting the activation of interferon regulatory factor 3 (IRF-3). As a result, BRSV is able to block the establishment of a cellular antiviral state. The characterization of interactions between virus (NS proteins) and the host cell (IFN system) will have important implications in the development of HRSV/BRSV vaccines
![Biosynthese des Metallzentrums von [NiFe]-Hydrogenasen aus E. coli](https://cdn.podcastcms.de/images/shows/175/2312160/s/624791931/biosynthese-des-metallzentrums-von-nife-hydrogenasen-aus-e-coli.png)
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In dieser Arbeit wurden drei Aspekte der Reifung der Hydrogenasen in E. coli näher untersucht: 1. Eine Deletion im carAB-Locus führt zum Verlust der Synthese aktiver Hydrogenasen in E. coli. Die Aktivität kann wiederhergestellt werden, wenn der Stamm mit einem carAB-tragenden Plasmid transformiert oder wenn er in Anwesenheit von Citrullin angezogen wird. Da der carAB-Locus für das Enzym der Carbamoylphosphat-Synthese kodiert und Citrullin in der Zelle in Carbamoylphosphats umgewandelt werden kann, ist Carbamoylphosphat die Ausgangssubstanz für die Synthese der Liganden des Metallzentrums. Aufgrund seiner Struktur wurden Reaktionsmechanismen postuliert, über die es in CN- und/oder CO-Einheiten umgewandelt werden kann. 2. Dem HypF-Protein konnte die biochemische Funktion einer Carbamoylphosphat-Phosphatase zugeschrieben werden, zusätzlich besitzt es eine an die Anwesenheit von Carbamoylphosphat gekoppelte ATP-hydrolysierenden Aktivität. Die ATP-Hydrolyse durch HypF führt zur Bildung von AMP und PPi und sie geht parallel mit der Ausbildung eines adenylierten Reaktionsintermediats wie über die Pyrophosphat-ATP-Austausch-Reaktion gezeigt wurde. Beim adenylierten Intermediat handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Carbamoyl-Adenylat. Es wird postuliert, dass dieses Substrat vom HypE-Protein zur Bildung des CN-Liganden durch einen Wasserentzug über eine PurM-ähnliche Reaktion verwendet wird. Durch spezifische Mutagenisierung konnten HypF-Varianten konstruiert werden, die zur Bildung aktiver Hydrogenasen unfähig waren. Die drei strukturell auffälligsten Motive des HypF-Proteins (Acylphosphat-Phosphatase-, Zink-Finger- und O-Carbamoyl-Transferase-Motiv) sind wichtig für die optimale Reifung der Hydrogenasen. Diese in vivo Unfähigkeit der Mutanten aktive Hydrogenasen zu synthetisieren geht mit dem Verlust der Carbamoylphosphat-Phosphatase einher. 3. Die kristallographische Analyse des HybD-Proteins als Beispiel einer spezifisch an der Hydrogenasen-Reifung beteiligten Protease, zeigte die Anwesenheit einer essentiellen Metallbindetasche, an deren Ausbildung Glu, Asp und His beteiligt sind und die in einer Peptidbindungsfurche liegt. Die Metalltasche fungiert spezifisch als Nickelerkennungsstelle in der Prozessierung, da nur Nickel-enthaltendes Apo-Protein prozessiert werden kann
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In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen Säugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthält eine HR-Kassette mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele können nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden, dessen zelluläre Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen, biochemischen und zellulären Analyse zu etablieren. Das pGrec-HR-Meßsystem wurde an zwei isogenen Zellpärchen angewendet. Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al., 2002)) konnte die vermutete Störung der HR in den Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso scheint die Rate der homologen Rekombination in Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden, deren Störung mit der Mutagenüberempfindlichkeit (MMS) und chromosomalen Instabilität von CL-V4B-Zellen korreliert. Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996). Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche Einflüsse der Chromatinstruktur an einem spezifischen Integrationsort zu umgehen. Das Zellpärchen AT-pEBS (Atm(-/-), transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der für humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert. Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen statistisch signifikant erhöht (34 - 43-fach). Somit wäre erstmals eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch, dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen erhöht zu sein scheint (6-fach). Mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen Ansätzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert. Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert und somit prinzipiell in allen Säugerzellen anwendbar. Insgesamt stellt pGrec also ein sehr sensitives und nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer und zellulärer Ebene dar.
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Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen.
