Etablierung eines neuen Rekombinations-Meßsystems und Nachweis der Störung homologer Rekombination in Atm- und Rad51C-defizienten Säugerzell-Mutanten

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur
Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen
Säugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthält eine HR-Kassette
mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die
durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele
können nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden,
dessen zelluläre Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und
Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels
Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren
und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen,
biochemischen und zellulären Analyse zu etablieren. Das
pGrec-HR-Meßsystem wurde an zwei isogenen Zellpärchen angewendet.
Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und
deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al.,
2002)) konnte die vermutete Störung der HR in den
Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et
al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig
nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist
die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der
Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso
scheint die Rate der homologen Rekombination in
Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte
erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden,
deren Störung mit der Mutagenüberempfindlichkeit (MMS) und
chromosomalen Instabilität von CL-V4B-Zellen korreliert.
Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch
chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996).
Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur
Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche
Einflüsse der Chromatinstruktur an einem spezifischen
Integrationsort zu umgehen. Das Zellpärchen AT-pEBS (Atm(-/-),
transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM
ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der für
humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert.
Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der
AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen
statistisch signifikant erhöht (34 - 43-fach). Somit wäre erstmals
eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci
gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch,
dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen
erhöht zu sein scheint (6-fach). Mögliche Gründe für die
unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen
Ansätzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert.
Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert
und somit prinzipiell in allen Säugerzellen anwendbar. Insgesamt
stellt pGrec also ein sehr sensitives und nützliches Werkzeug zur
Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer
und zellulärer Ebene dar.