Identifikation und Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des CDK-Inhibitors p27Kip1

Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivität
verschiedener Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) reguliert. Die
zelluläre Menge des CDK-Inhibitorproteins p27Kip1 spielt eine
entscheidende Rolle beim Übergang der Zelle von der G1- zur SPhase.
Die Menge von p27Kip1 steigt während der G0- oder der G1-Phase an
und nimmt zu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von
p27Kip1 an die CDKKomplexe der G1-Phase inaktiviert diese und
verhindert dadurch die Initiation der SPhase. Eine verminderte
Menge von p27Kip1 am G1/S-Phaseübergang findet man dagegen häufig
in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zelluläre Menge des
Inhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und
einem aggressiven Verlauf der Erkrankung verbunden. Die zelluläre
Aktivität und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine
reguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden
deshalb mit Hilfe von rekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des
Inhibitors in HeLa-Zellextrakt identifiziert. Es konnte gezeigt
werden, daß p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2
ist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion
zwischen p27Kip1 und Grb2 könnte damit, nach Stimulation der Zelle
durch verschiedene Mitogene, die Signalweitergabe mit der
Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion
notwendige Domäne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine
acht Aminosäuren lange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf
der anderen Seite interagiert Grb2 vornehmlich über seine
C-terminale SH3-Domäne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1 nah
verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren
dagegen nicht mit Grb2. In einer erweiterten Analyse wurden 41
verschiedene rekombinante SH3-Domänen auf eine Interaktion mit
p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 nur mit
der C-terminalen SH3-Domäne von Grf40/Mona und der SH3-Domäne der
Tyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase
Lyn in vivo führte zur Hypothese, daß p27Kip1 durch Lyn
phosphoryliert werden könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde
deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht. In
Phosphoaminosäureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte
gezeigt werden, daß p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten
phosphoryliert wird. Diese Zusammenfassung 13 Phosphorylierung
konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und
verschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin
88 und 89 eingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des
trimeren Komplexes aus p27Kip1, CDK2 und Cyclin A kommt der
Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der Kinase zu
liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit
eine Phosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einfluß auf
die Aktivität des Inhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von
p27Kip1 verhindert nicht die Bindung an den CDK-Komplex. Allerdings
konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt werden, daß
eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der
Aktivität des Inhibitors führt. Diese Ergebnis konnte in vivo
bestätigt werden. Interessanterweise verstärkt die
Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die Phosphorylierung von
p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex. Die
Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein
initiales Signal zum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das
so markierte p27Kip1 wird von einem E3-Ligase-Komplex erkannt und
ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die
Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In
Halbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von
p27Kip1 und einer Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1
konnte zeigten werden, daß beide Formen, im Vergleich zu
unverändertem p27Kip1, eine höhere Stabilität aufweisen. Die
Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die
Inaktivierung des Inhibitors durch die Phosphorylierung von
Tyrosinresten zeigt eine Möglichkeit auf wie p27Kip1, in
Abhängigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in
dieser Arbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit
p27Kip1 verbindet damit die Signaltransduktion mit der
Zellzykluskontrolle.