Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Aufgrund fehlender Methoden wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nur selten eine molekulargenetische Analyse von Einzelzellen durchgeführt. In vielen Bereichen aber, wie beispielsweise den Tumoren, ist sie von entscheidender Bedeutung. Das Auftreten eines genetisch heterogenen Musters in einem Tumor könnte die Suche nach krankheitsauslösenden oder -fördernden Veränderungen erschweren. Auch bei der Untersuchung von seltenen Zellen (so genannte „rare cell events“), z.B. bei einer minimalen residualen Tumorerkrankung sind geeignete Methoden zur Einzelzellanalyse notwendig, da nur wenig Material zur Verfügung steht. Ziel dieser Doktorarbeit war es, zwei molekulargenetische Analysemethoden zu etablieren, weiterzuentwickeln und in einer geeigneten Strategie bei der Untersuchung von disseminierten Tumorzellen bei fünf Mammakarzinomen einzusetzen. Im ersten Teil der Doktorarbeit erfolgte die Auswahl eines geeigneten Markierungssystems für die Identifizierung disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Die Benutzung des pan-Zytokeratin Antikörpers A45 B/B3 direkt konjugiert mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder FluorX zeigte in verschiedenen Testsystemen die besten Ergebnisse. Sowohl seine Spezifität als auch die Durchführbarkeit einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) war möglich. Anhand disseminierter Tumorzellen von Nierentumoren wurde die Möglichkeit einer Untersuchung mittels zweier Interphase FISH Ansätze überprüft. Die Hybridisierung der Zentromernahen YAC Sonden konnte auf dem Knochenmarksgewebe bei pan-Zytokeratin positiven Zellen nach Erproben mehrerer Protokolle nicht durchgeführt werden, allerdings war die Hybridisierung von Zentromersonden erfolgreich. Die Optimierung des veröffentlichten Protokolls zur Einzelzell CGH (C. Klein et al. 1999; N. Stöcklein et al.2002) war das zweite Ziel der Arbeit. Diese Optimierung war notwendig, weil sich das ursprünglich publizierte Protokoll als Artefakt anfällig herausstellte. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen Protokollveränderungen konnte die für Einzelzell Analysen notwendige Reproduzierbarkeit erreicht werden. Als Testsystem wurde eine molekulargenetisch ausreichend charakterisierte und in ihren Veränderungen stabile Zelllinie gewählt (RCC-26). Die ersten Versuche zur Einzelzellanalyse zeigten Veränderungen in der Zelllinie, die in allen vorangegangenen Analysen mit etablierten Techniken (M-FISH und CGH) nicht gezeigt werden konnten. Eine Optimierung des Protokolls führte zu übereinstimmenden Ergebnissen von Einzelzell CGH, CGH und M-FISH. Anschließend konnte die Reproduzierbarkeit dieser Methode anhand der Zelllinie RCC-26 gezeigt werden. Die Anwendung beider Methoden zur Analyse von seltenen Zellen wurde mit der Untersuchung von fünf Mammakarzinomen dargelegt. Der Vergleich von Primärtumor und kultivierten disseminierten Tumorzellen ins Knochenmark zeigte im Rahmen der untersuchten Fälle gemeinsame molekulargenetische Veränderungen beider Tumorentitäten. Mit der Anwendung dieser neuen Methoden ist es möglich detaillierte Informationen über seltene Zellen zu erhalten und diese in den biologischen Kontext einzuordnen.

Aufgrund der Zunahme an Organ- und Knochenmarkstransplantationen und der damit verbundenen Immunsuppression bzw. immunsuppressiven Therapie sowie der zunehmenden Zahl an AIDS-Patienten ist das Zytomegalovirus (CMV) als Pathogen in den letzten zwanzig Jahren trotz der Einführung wirksamer antiviraler Medikamente bis heute von großer klinischer Bedeutung. Während bei immunkompetenten Personen eine primäre CMV-Infektion durch das Immunsystem kontrolliert werden kann, führt eine Primärinfektion oder eine Reaktivierung einer latenten CMV-Infektion in immunsupprimierten Patienten zu lebensbedrohlichen Komplikationen. Die Pathogenese einer CMV-Infektion wird entscheidend von der Qualität der antiviralen Immunantwort des Wirtes beeinflusst und Kenntnisse über die Interaktion von CMV mit dem Immunsystem sind für die Prophylaxe und Behandlung einer CMV-Infektion von großer Bedeutung. Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems und spielen bei der Initiierung einer antiviralen Immunantwort eine zentrale Rolle. Die Stimulation von naiven T-Zellen durch DCs und die Auslösung einer zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort trägt entscheidend zur Eliminierung von viral-infizierten Zellen bei. Die Interaktion des Zytomegalovirus mit dendritischen Zellen gibt dem Virus eine Möglichkeit, seine Eliminierung durch das Immunsystem des Wirtes entscheidend zu beeinflussen. Zur Identifikation von Zielzellen für latente und lytische Infektionen durch MCMV und zur Untersuchung der Auswirkungen einer MCMV-Infektion auf den Phänotyp und die Funktion der Zellen wurde die murine hämatopoetische Stammzelllinie FDCP-Mix als Modellsystem verwendet. Definierte Differenzierungsstadien der Zellen entlang der dendritischen Reihe wurden hierzu mit einer GFP-exprimierenden MCMV-Mutante infiziert. Während undifferenzierte FDCP-Mix-Zellen und von FDCP-Mix-Zellen abgeleitete reife DCs nicht produktiv infizierbar waren, setzten unreife DCs infektiöse Virusnachkommen frei. In reifen DCs wurden nur virale Proteine der sehr frühen und frühen Phase der viralen Genexpression synthetisiert, während späte Genprodukte nicht nachgewiesen werden konnten. Die Infektion unreifer und reifer DCs resultierte anfänglich in deren Aktivierung, erkennbar an der vorübergehend verstärkten Expression der Oberflächenmoleküle CD80, CD86, CD40, MHC-Klasse-I und Klasse-II. Die verstärkte Expression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf reifen DCs einige Stunden nach Infektion spiegelte sich in einer gesteigerten Stimulation naiver autologer T-Zellen durch infizierte DCs wider. In der späten Phase der Infektion war die Aktivierung von autologen T-Zellen beeinträchtigt. Dies korrelierte mit der reduzierten Oberflächenexpression der MHC- und ko-stimulatorischen Moleküle auf infizierten reifen DCs. Allogene T-Zellen konnten durch MCMV-infizierte DCs weder in der frühen noch in der späten Phase der Infektion stimuliert werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass DCs im Laufe einer MCMV-Infektion mehrere Rollen spielen: (1) unreife DCs produzieren MCMV-Nachkommen und können so zur Verbreitung des Virus im Wirt beitragen; (2) in einem frühen Stadium der Infektion aktivieren DCs naive T-Zellen und initiieren damit eine antivirale Immunantwort, die einer Ausbreitung der viralen Infektion entgegenwirkt. (3) Zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion ist die Stimulation der T-Zell-Proliferation durch MCMV-infizierte DCs beeinträchtigt. Dies ist einer der Mechanismen, welche die Persistenz des Virus in seinem Wirt ermöglichen. Unabhängig vom Zeitpunkt der Infektion ist bei der allogenen Transplantation die Induktion der T-Zell-Antwort immer beeinträchtigt. Die Unfähigkeit der CMV-infizierten DCs, naive allogene T-Zellen zu stimulieren, trägt so zu einer reduzierten antiviralen Kontrolle bei, was CMV-verbundene Krankheiten nach allogenen Knochenmarkstransplantationen begünstigt und gravierende gesundheitliche Probleme zur Folge hat.

Ziel der Arbeit ist, eine Methode des Pigmentaustauschs am Photosystem II Reaktionszentrum zu optimieren. Es konnten eine Reihe von Chorophyll-ähnlichen Pigmenten in das RC integriert werden. Dabei wurde ein Chlorophyll a (Chl) gegen ein [Ni2+]-Chlorophyll a (Ni-Chl), ein [3-Acetyl]-chlorophyll a (Ac-Chl) sowie ein [3-Acetyl]-Demethoxycarbonyl-Chlorophyll a (Ac-Py-Chl) ausgetauscht. Der Austausch mit [Zn2+]-Chlorophyll (Zn-Chl) und [Zn2+]-Methylchlorophyllid (Zn-Me-Chlid) führte ebenfalls zu den Ersatz eines Chl, wobei aber die Gesamtanzahl der Tetrapyrrolpigmente erhöht wurde. Mit Porphyrinen (Protochlorophyll) und Bakteriochlorinen konnte kein Austausch festgestellt werden. Die Bindungstasche ist demnach für Pigmente zugänglich, bei denen die Peripherie und/oder das Zentralmetall verändert wurde, während das Chlorinkonjugationssystem erhalten bleiben muss. Das System zur Modifikation der Chlorin Kofaktoren am 6-Chlorophyll Reaktionszentrum (6-Chl PS II-RC) konnte auch für die Pigmentrekonstitution von 5-Chlorophyll-Reaktionszentren verwendet werden. Durch die Einführung eines nativen Chl in das RC konnte gezeigt werden, dass die Extraktion des Chlorophylls reversibel ist. Die Einführung von [3-Acetyl]-chlorophyll a, [Ni2+]-Chlorophyll a und [Zn2+]-Chlorophyll a war möglich, wobei nur das fehlende Chlorophyll ersetzt wurde. Die Produkte der Rekonstitution und des Austauschs von Pigmenten an 5-Chl bzw. 6-Chl PS II-RC gleichen sich, sodass es sehr wahrscheinlich ist, dass mit beiden Verfahren das gleiche Chlorophyll verändert wird. Aufgrund des langsameren Energietransfers (s.u.) und der kürzlich veröffentlichten Röntgenstruktur [4] wurde dies einem peripheren Chl zugeordnet, welches über Histidin 118 an die D1-Untereinheit gebunden ist. Es wurden Hinweise auf eine unvollständige Energieäquilibrierung zwischen den peripheren Chlorophyllen und den Pigmenten im Kern des RC (vier Chlorophylle und zwei Pheophytine) gefunden. Das hierfür stärkste Argument ist, dass die Einführung einer effizienten Energiefalle (Ni-Chl) nur ein geringes Löschen der Fluoreszenz (um 25 %) bewirkt. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass eine Modifikation der Chlorophylle im PS II-RC grundsätzlich möglich ist, wobei der Austausch selektiv auf eines der sechs beschränkt war, d.h. auf ein peripheres Chl gebunden an D1 über Histidin 118.

The cyclase-associated protein (CAP) from Dictyostelium discoideum was studied in detail regarding its structure and function relationships. The second part of the thesis describes the characterization of the novel actin-related protein filactin from D. discoideum. CAP homologs are multifunctional proteins: they are involved in signal dependent changes in the actin cytoskeleton, in vesicle transport and cell development. The binding of monomeric actin through the C-terminal domain represents a common feature of all CAPs. From four highly conserved regions in this domain the verprolin homology region of the D. discoideum CAP was analyzed in this work. Loss of this region led to a clear decrease, but not suppression of the actin-sequestering activity. In agreement to these data, stable complexes of the modified CAP-C with G-actin could be identified in chemical crosslinking experiments, and it could be shown that CAP-C is able to dimerize. Considering the high conservation of cyclase-associated proteins and their importance for cell biological processes it is remarkable that no structure of this protein has been elucidated so far. Therefore, in the frame of this thesis the structure of the membrane-associated N-terminal domain of D. discoideum CAP was to be determined in cooperation with the group of T. Holak at the MPI f. Biochemistry (Martinsried). For this purpose numerous constructs from the N-terminal domain had to be cloned and expressed, to be purified and examined for their stability and threedimensional folding. It turned out that the stable core of the aminoterminal domain covers the amino acids 51-226. The structure was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography. Six antiparallel a-helices are connected by loop elements and form a cylindrical core domain which can form a dimer in the crystal, dimerization occurs through Mg2+ ions. The clarification of the N-terminal structure of D. discoideum CAP will now simplify the research on its interaction with phospholipids and CAP binding proteins The second part of this work dealt with the characterization of filactin. The unique 105 kDa protein contains two filamin homologous regions in its N-terminal, and a clearly actin-related domain within the C-terminal part. While in resting cells the endogenous filactin shows cytoplasmic distribution and interaction with protein aggregates as well, the GFP construct of the actin-related domain displays an actin-like behavior during cell movement or phagocytosis. A stimulus-induced colocalization of actin and filactin was observed in experiments with chemotactically stimulated cells. The alignment of its C-terminal amino acid sequence with the structure of muscle actin predicts a globular, actin-related structure containing all residues that are important for ATP/ADP binding.

In dieser Arbeit wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung angewandt, um neue Virulenzfaktoren zu finden, die spezifisch für hochpathogene Yersinia enterocolitica Stämme sind. Hierfür wurde die DNA eines nicht pathogenen „Treiber”-Stammes (Y. enterocolitica NF-O, Biotyp 1A) gegen die DNA eines hochpathogenen „Tester”-Stammes (Y. enterocolitica WA-314, Biotyp 1B) subtrahiert. Mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung konnten verschiedene Tester-spezifische Sequenzen ermittelt werden, die sowohl für bereits bekannte als auch neue potentielle Virulenzmarker kodieren. In dieser Arbeit konnte ein neues TypII-Sekretionscluster, genannt yts1 (Yersinia TypII Sekretion 1), ermittelt werden. Das yts1-Gencluster umfasst ein 13 kb großes Operon-ähnliches Modul, welches die Gene yts1C-S enthält. Mittels reverser Transkription/PCR konnte eine bevorzugte Transkription bei 37 °C gezeigt werden. Southern Blot-Analysen sowie PCR haben gezeigt, dass das yts1-Gencluster nur in den hochpathogenen Y. enterocolitica Stämmen vorkommt. Dagegen sind yts1-Gene weder in schwachpathogenen sowie apathogenen Y. enterocolitica Stämmen noch in Y. pseudotuberculosis- und Y. pestis-Isolaten zu finden. Durch Inaktivierung des yts1E-Gens in Y. enterocolitica wurde eine Mutante hergestellt und hinsichtlich Mauspathogenität mit dem Mutterstamm verglichen. Bei oraler Infektion der Mäuse erwies sich die yts1E-Mutante als attenuiert (geringere Keimzahlen) in Leber und Milz im Vergleich zum Mutterstamm. Im Gegensatz dazu konnte bei intravenöser Infektion der Mäuse kein Unterschied zwischen Mutante und Mutterstamm festgestellt werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das TypII-Sekretionssystem die Erregerdissemination von den Peyer-Plaques in Milz and Leber fördert. Das yts1-Sekretionscluster grenzt stromabwärts an ein Gen, welches für ein potentielles Chitin-Bindungsprotein (ChiY) kodiert. ChiY ist ein mögliches Substrat des Yts1-Sekretons. Sequenzanalysen sagen voraus, dass ChiY ein 55-kDa Protein mit zwei definierten Chitin-Bindungsdomänen ist, von denen sich die eine Domäne am N- und die andere am C-Terminus des Proteins befindet. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes ChiY Chitin bindet. Sequenzanalysen des zugänglichen fast kompletten Genoms von Y. enterocolitica 8081 (Biotyp 1B) führten zum Nachweis eines möglichen zweiten TypII-Sekretionscluster, das in dieser Arbeit als yts2 bezeichnet wird. Wie mittels PCR gezeigt werden konnte, kommt yts2 - im Gegensatz zu Y. pseudotuberculosis und Y. pestis - in allen getesteten pathogenen und apathogenen Y. enterocolitica-Stämmen vor. Reverse Transkriptionsanalysen/PCR zeigten, dass die yts2 - Gene bevorzugt bei 27 °C abgelesen werden. Mittels subtraktiver Technik konnte auch ein neues Insertionselement (IS1330) charakterisiert werden. Durch Southern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass IS1330 nur in pathogenen Y. enterocolitica Serotypen vorkommt und somit für die epidemiologische Typisierung dieser Spezies eingesetzt werden kann. Diese Arbeit repräsentiert einen neuen Ansatz zur Aufklärung von unterschiedlichen intraspezifischen Genomsequenzen von Y. enterocolitica mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung, um unser Verständnis der genetischen Vielfalt und Heterogenität dieser bakteriellen Spezies zu erweitern. Das zum ersten Mal hier beschriebene yts1-Cluster repräsentiert einen neuen Lokus, der eine wichtige Rolle für die Pathogenese der hochpathogenen Y. enterocolitica Stämme spielt.

Dendritic spines are the main sites of synaptic input onto excitatory neurons. As recent experiments showed that synaptic activity and especially long-term potentiation (LTP) can modify spine morphology and number, I studied the effect of long-term depression (LTD) on these parameters. I used a local stimulation approach in combination with intracellular recordings and 2-photon-laser-microscopy to spatially restrict the area of induced synaptic activity. My experiments indicate that spine morphology was stable over time with only very little changes occurring following the induction of LTD. The number of large, prominent spine changes was very low. Only small, stubby spines disappeared significantly after local LTD induction.

Mit Hilfe der siggnature tagged mutagenesis (STM) wurden Gene bei Helicobacter pylori identifiziert, die für die das Überleben von Helicobacter pylori im Magen von Mongolischen Wüstenrennmäusen essentiell sind.

Phenotypic plasticity is common in predator-prey interactions. Prey use inducible defenses to increase their chances of survival in periods of high predation risk. Predators, in turn, display inducible offenses (trophic polyphenisms) and adjust their phenotypes to the prevailing type of prey. In the past, inducible defenses have received considerably more attention than inducible offenses. Here, I point out three areas where taking a predator perspective can increase our understanding of phenotypic plasticity in predator-prey systems. In Part 1, I describe an inducible offense in the predatory ciliate Lembadion bullinum: Mean cell size in a genetically uniform Lembadion population increases with the size of the dominant prey species. This size polyphenism can be explained as the result of a trade-off: Large Lembadion are superior in feeding on large prey, whereas small Lembadion achieve higher division rates when small prey is available. Consequently, inducible predator offenses may evolve as adaptations to environments where important prey characteristics vary over space or time. In Part 2, I investigate the interplay of Lembadion's inducible offense with an inducible prey defense. Lembadion releases a kairomone (i.e. an infochemical) that induces defenses in several prey species. For example, in the herbivorous ciliate Euplotes octocarinatus, it triggers the production of protective lateral "wings". I show that Lembadion can reduce the effect of this defense by activating its inducible offense. This is one of the first known examples of reciprocal phenotypic plasticity in a predator-prey system. While the counter-reaction of Lembadion decreases the fitness of the prey, it could not be shown to significantly increase the fitness of Lembadion itself. Nevertheless, I discuss the hypothesis that phenotypic plasticity in both species is a result of (diffuse) coevolution. In Part 3, I further pursue the idea of coevolution and develop a mathematical model of a coevolving predator-prey pair which displays reciprocal phenotypic plasticity. In this model, the inducible offense is a truly effective counter-adaptation to the prey's defense. The model yields three main conclusions: First, the inducible prey defense can stabilize predator-prey population dynamics. The effect of the inducible counter-offense is less clear and depends on the relative magnitude of its costs and benefits. Second, the maintenance of phenotypic plasticity requires that both the defense and the offense are sufficiently strong. Third, preliminary results suggest that an inducible offense is favored over a constitutive (permanently expressed) one if and only if the model populations perform predator-prey cycles. This leads to the hypothesis that phenotypic plasticity may evolve as an adaptation to temporal heterogeneity created by the internal dynamics of predator-prey systems.

Seasonal timing in different environments: comparative studies in Stonechats. Stonechats from four populations (Kenya, Sibiria, Ireland, Austria) were compared during their first year of life at the Max-Planck Research Centre for Ornithology in Andechs, Germany. They differed in temporal patterns of their seasonal behavior and in their reaction norms to important Zeitgebers (e.g., photoperiod). These differences were taylored to their native habitats, and there is evidence that they can rapidly be modified via micro-evolution. Implications for adjustment to changing seasonal conditions (climate change) are discussed.

Diese Arbeit befaßt sich mit der Objekterkennung durch Echoortung bei der Fledermaus Megaderma lyra und zeigt welche Rolle hierbei die zeitliche Integration akustischer Information spielt. Es werden zwei psychoakustische Experimente beschrieben, deren Ergebnisse mit adäquaten Modellen verglichen werden und somit einen Einblick in die Verarbeitungsmechanismen des auditorischen Systems von M. lyra gewähren. Das erste Experiment untersucht die Objekterkennung durch Echoortung anhand der spontanen Klassifizierung unbekannter virtueller Objekte im Rückspielexperiment. Hierbei ist von Interesse, welche Klassifizierungsstrategie bei der Objekterkennung Anwendung findet. Bewertet M. lyra Objekte durch den Vergleich unterschiedlicher Objektechos oder ist sie fähig das akustische Abbild eines Objektes durch eine Kreuzkorrelation ihres Lautes mit dem Objektecho zu extrahieren? Der Vergleich der Ergebnisse aus dem Verhaltensexperiment mit der Klassifizierung der Testobjekte durch unterschiedliche Modelle weist darauf hin, daß M. lyra tatsächlich die Fähigkeit besitzt, das akustische Abbild unbekannter Objekte zu extrahieren. Zudem zeigt der Vergleich mit der Klassifizierung durch ein auditorisches Modell, daß die Echoinformation von Objekten kleiner als 6,6 cm im peripheren auditorischen System spektral kodiert wird. Die Ergebnisse einer begleitenden Analyse der Echoortungslaute während des Verhaltensexperiments deuten darauf hin, daß M. lyra ihr Echoortungsverhalten zur spontanen Klassifizierung unbekannter Objekte nicht adaptiv verändert, sondern in gleicher Weise einsetzt wie bei der Klassifizierung bekannter Objekte. Das zweite Projekt befaßt sich mit den Einflüssen zeitlicher Verarbeitungsmechanismen auf die Echoabbildung. Hierzu wird die zeitliche Integration akustischer Information in Abhängigkeit des zeitlichen Abstandes zweier Schallereignisse sowohl unter passiv-akustischen Bedingungen als auch im Echoortungskontext untersucht. Unter beiden Bedingungen können bei M. lyra gleichermaßen kurze Integrationszeiten von weniger als 200 µs beobachtet werden. Der Vergleich der Ergebnisse aus dem Verhaltensexperiment mit einem auditorischen Modell der Gehörperipherie von M. lyra zeigt, daß die zeitliche Integration kurzer Signalpaare anhand der Überlappung cochleärer Filterantworten erklärt werden kann. Demnach kann das periphere auditorische System von M. lyra Objektstrukturen von weniger als 3,4 cm nicht zeitlich auflösen und somit nur spektral kodieren. Objektstrukturen von mehr als 3,4 cm könnten hingegen zeitlich aufgelöst und somit zeitlich kodiert werden. Wie die Ergebnisse des ersten Experiments zeigen, wird jedoch die akustische Information von Objekten bis zu 6,6 cm peripher rein spektral kodiert und die zeitliche Information nicht genutzt.

Plastid gene organisation maintains characteristics typical of its prokaryotic ancestry. The regulation of plastid gene expression however strongly deviates from that one its free-living cyanobacteria relatives. This intriguing complication of plastid gene expression characteristics is the result of an integration process of the cellular subgenomes that introduced eukaryotic traits into the formerly prokaryotic compartment (Herrmann et al. 1997). An interesting example for this process is the transcription system, which consists of both prokaryotic (PEP) and eukaryotic (NEP) RNA polymerases. In order to understand, how far the transcriptional apparatus within plastids was adapted to nuclear needs, three approaches have been undertaken. Firstly, the tobacco homologues of the NEP-enzymes known from Arabidopsis were determined and characterised. Secondly, an extensive transcript analysis for all plastid operons was carried out with wild-type and PEP-lacking material in order to assess the contribution of the two systems to transcription. In order to rapidly screen this plant material, an array-based technique was established. As no arrays for the plastid chromosome had been described, the preparation of the filters, optimisation of hybridisation conditions and probe preparation together with the use of the proper controls was one of the main challenges of this work, in particular as macroarrays are interesting for various other applications. Thirdly, to assess the regulation of PEP expression, an in vivo analysis of the promoter for the rpoB operon was performed. According to data from other groups, this operon is controlled by NEP, which - in addition to other data - led to the suggestion that PEP is switched on by NEP (Hajduckiewicz et al., 1997). To test this, point mutations of the described NEP rpoB promoter (Liere and Maliga; 1999) should be prepared and introduced into the plastid compartment by particle transformation. Insight into the regulation of PEP is crucial in order to understand the interplay of the two RNA polymerase systems. Finally, in addition to studies on plastid transcription, later steps in plastid gene expression were examined in the course of this work as well. As a model to study assembly of a multisubunit complex, the cytochrome b6/f complex was analysed by a gene-disruption approach. Deletion and/or insertion mutants of all plastid encoded subunits of the complex were prepared in order to evaluate the assembly strategy for the holocomplex.