Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Profilin is an ubiquitous cytoskeletal protein whose function is fundamental to the maintenance of normal cellular physiology. Site-directed mutagenesis of profilin II from Dictyostelium discoideum by PCR resulted in the point mutations W3N and K114E, whereby the W3N profilin is no longer able to bind to poly-(L)-proline concomitant with a slight reduction in actin-binding, whereas the K114E profilin shows profound decrease in its ability to interact with actin but its affinity for poly-(L)-proline remained unaltered. The in vivo properties of the point-mutated profilins were studied by expressing either W3N or K114E in the profilin-minus D. discoideum mutants which have defects in the F-actin content, cytokinesis and development (Haugwitz et al., 1994). Expression resulted in normal cell physiology, a reduction in the F-actin content, and a complete development. Interestingly, only cells which overexpressed W3N could restore the aberrant phenotype, while the K114E profilin with its fully functional poly-(L)-proline binding and its strongly reduced actinbinding activities rescued the phenotype at low concentrations. Both the wild-type and pointmutated profilins are enriched in phagocytic cups during uptake of yeast particles. These data suggest a) that a functional poly-(L)-proline binding activity is more important for suppression of the mutant phenotype than the G-actin binding activity of profilin, and b) that the enrichment of profilin in highly active phagocytic cups might be independent of either poly-(L)-proline or actin-binding activities. To have a better understanding of the in vivo role of profilin, D. discoideum profilin II has been tagged at its C-terminus with the green fluorescent protein (GFP) with a 100-aa linker separating profilin and GFP. This fusion construct was introduced in D. discoideum profilinminus cells and expression of the fusion protein could restore the aberrant phenotype partially. The partial rescue might be due to the uneven expression of the fusion protein leading to mixed populations even after repeated recloning. The profilin-GFP transformants showed normal cell morphology, could be cultivated in shaking suspensions, and could develop fruiting bodies which closely resembled those of the wild-type. In vivo studies revealed the distribution of the fusion protein in highly active regions of the cells such as phagocytic cups, macropinocytotic crowns, cell cortex and at the leading edges of locomoting cells. Thus profilin appears to play a significant role in the regulation of the dynamic actinbased cellular processes. A second actin-regulatory protein from D. discoideum namely, severin, a Ca2+-dependent Factin fragmenting and capping protein, was also investigated via fusion to GFP at its C-terminus. Although severin is a very active F-actin fragmenting protein in in vitro assays, the severin null D. discoideum mutant exhibits normal growth, cell motility, chemotaxis and development. Examination of the live dynamics of severin-GFP should clarify the in vivo role of severin and other functionally redundant cytoskeletal proteins. The 70 kDa severin-GFP fusion protein has been sufficiently expressed and partially purified from the severin null cells whereby in vitro assays confirmed the ability of this fusion protein to sever F-actin only in the presence of Ca2+. Data from confocal microscopy showed that the fusion protein was transiently detected in macropinocytotic crowns, phagocytic cups, membrane ruffles, at the leading edges of motile cells and cell-cell contacts of aggregating cells in directed motion. These data suggest an in vivo role for severin in the remodulation of existing F-actin structures as supported by the in vitro data. The highly dynamic cytoskeleton also plays a significant part in the defence of the cells against pathogens. The behaviour of the actin cytoskeleton of cultured mammalian cells in response to Yersinia enterocolitica infection was examined by confocal microscopy with the aid of GFP-tagged actin, cofilin and profilin II. The translocated Yersinia outer proteins (Yops) encoded by a virulence plasmid in the wild-type bacteria have been observed to disrupt the actin microfilaments, resulting in diffuse actin staining which subsequently disappeared completely upon prolonged bacterial infection. In addition, F-actin structures resembling phagocytic cups were found at the sites of bacterial adherence, suggesting the likelihood of the involvement of the Rho family of small GTPases in the regulation of the actin cytoskeleton. The secreted Yops appeared to have no major effect on the distribution of GFP-profilin whereas the staining pattern of GFP-cofilin seemed to be modified by the Yops, resulting in a decrease in length of the actin-cofilin rods and a diffuse localization of cofilin. The exact mechanisms of interaction between the Yops and their host targets remain to be determined. However, a clearer insight into the interaction between pathogens and the host cytoskeleton will certainly aid in the cellular defence and the prevention of pathogenesis.

Die Identifizierung von Genen, deren Expression Einfluß auf die Metastasierung von Tumoren nimmt, stellt eine Möglichkeit zur Verbesserung sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Ansätze in der Behandlung von Krebs dar. Jede achte Frau in westlichen Industrienationen erkrankt an Brustkrebs, wobei die Entwicklung neuer Methoden zur frühzeitigen Erkennung von Metastasen und deren zielgerichtete Behandlung entscheidend ist, um eine Therapie von Patientinnen mit progressivem Mammakarzinom zu ermöglichen. Entwickelt sich eine Zelle eines Primärtumors zu einer invasiven metastasierungsfähigen Zelle, so ist für diese Veränderung des Phänotyps eine grundlegende Modifizierung in der Expression zahlreicher Gene zu erwarten. In einem zellulären Modellsystem für die Progression des Mammakarzinoms wurde in der invasiven Zellinie MCF-7ADR das „Progressions-assoziierte Protein“ (PAP) identifiziert, in der nicht-invasiven Zellinie MCF-7 konnte dagegen keine Expression nachgewiesen werden. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit ist die Klärung der Bedeutung der Expression dieses Gens für die Veränderung einer Zelle von einem nicht invasiven hin zu einem invasiven Phänotyp. PAP stellt ein Protein mit 157 Aminosäuren dar und gehört zur PMP22-Genfamilie, deren Mitglieder putative Viertransmembran-Rezeptoren sind. Neben der Hypothese der Einflußnahme von PAP auf die Metastasierungsfähigkeit einer Zelle werden für die Homologen eine Vielzahl zellulärer Funktionen postuliert, wie z.B. die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten, Adhäsionsvermittlung, Zellzyklusregulation, Tumorgenese und Apoptose. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien zeigten, daß PAP in einer Vielzahl von Normalgeweben exprimiert wird, mit Ausnahme von Geweben des Zentralen Nervensystems (ZNS) und peripherer Blutlymphozyten. Erste vergleichende Prävalenzstudien mittels Northern-Blot- Analysen zwischen Tumor- und Normalgewebe einzelner Patienten wiesen im Fall von Gewebeproben aus Organen des Zentralnervensystems eine positive Korrelation der PAP-Expression mit den Tumorproben auf. Eine Untersuchung von Mammakarzinom-Zellinien mit unterschiedlichem Metastasierungsgrad in der Nacktmaus belegte, daß PAP lediglich in den als metastasierend eingestuften Zellen exprimiert wurde. Über gekoppelte in vitro Transkription/Translation konnte gezeigt werden, daß die in einen Expressionsvektor klonierte PAP-cDNS für ein Protein mit einer Größe von etwa 18 kDa kodierte. Auch mittels Immunfluoreszenzstudien transient transfizierter COS-7-Zellen konnte die Expression eines Epitop-markierten Proteins und die Lokalisierung an der Zellmembran nachgewiesen werden. PAP exprimierende Zellen waren nicht apoptotisch, jedoch oft auffallend abgerundet. Einzelne Klone stabil transfizierter MCF-7-Zellen, die PAP konstitutiv exprimierten, zeigten kein anderes Wachstumsverhalten in Proliferationstests gegenüber der untransfizierten oder den mocktransfizierten MCF-7-Zellen. Auch ihr Verhalten in in-vitro-Invasionstests unterschied sich nicht von dem der Ursprungszellen, während MCF-7ADR hier starke Invasivität aufwies. Eine endgültige Aussage über eine Funktion von PAP bei der Invasion von Tumoren kann jedoch erst nach der Auswertung von Experimenten in Nacktmäusen gemacht werden. Durch Serumentzug wachstumsarretierte humane Primärzellen zeigten für PAP eine inverse Regulation im Vergleich zu dem homologen Protein PMP22. PAP wurde in proliferierenden Zellen stärker exprimiert als in arretierten, während für PMP22 ein Anstieg der RNS in arretierten Zellen zu beobachteten war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß alleine die Expression von PAP nicht ausreicht, um MCF-7- Zellen in vitro zur Invasion zu befähigen. Dafür könnten allerdings sowohl extrazelluläre Stimuli, als auch intrazelluläre Interaktionspartner fehlen, die zur Änderung des Phänotyps der Zellen und zur Invasion notwendig sein könnten. Da Rezeptoren jedoch in allen Schritten der Metastasierung von grundlegender Bedeutung sind, kann auch für PAP nicht ausgeschlossen werden, daß es in diesen komplexen zellulären Mechanismen eine Rolle spielt. Ein Einfluß auf die Proliferationsfähigkeit von Zellen konnte durch die konstitutive Expression von PAP nicht nachgewiesen werden. Eindeutig belegt werden konnte aber eine Korrelation mit dem Zellzyklus. Durch Serumentzug arretierte primäre Zellen zeigten eine verminderte PAP-Expression im Vergleich zu proliferierenden Zellen. Die Überexpression von PAP in COS-7-Zellen läßt allerdings die Vermutung zu, daß PAP, ebenso wie das homologe PMP22, einen Einfluß auf die Zellmorphologie und auf die Adhäsion von Zellen haben könnte. PAP könnte dabei in einen Adhäsion-regulierenden Mechanismus eingebunden sein, der bei einer Überexpression von PAP zu einem Abrunden der Zellen und einem Substratkontaktverlust führen könnte. Unter physiologischen Bedingungen könnte dies für das Loslösen der Zellen während der G2-Phase des Zellzyklus notwendig sein. Bei einer fehlerhaften Regulation (einer gesteigerten Expression von PAP) unter pathologischen Bedingungen könnte eine leichtere Loslösung von Tumorzellen die Metastasierung begünstigen. Denkbar wäre eine Interaktion von PAP mit Integrin- Rezeptoren, wodurch die Affinität des Integrins beeinflußt werden könnte. Diese Hypothese bietet einen Ansatzpunkt für weitere Studien bezüglich des Einflusses von PAP auf zelluläre Vorgänge, wie Zellzyklus-Regulation und Zellwanderung.

Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen- und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays) erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw. -gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden (z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende Analysen geklärt werden.

During the slug stage of cellular slime mold Dictyostelium discoideum, up to 105 cells coordinate their movement and migrate as a single organism. Slugs have a cylindrical shape with tip and tail; their morphological polarity corresponds to the polarity of migration. A large body of results suggest that cyclic AMP-mediated cell-cell signaling is the mechanism coordinating multicellular movement. Waves of cyclic AMP generated at the anterior tip propagate towards the tail and induce the chemotactic movement of cells toward the tip. Slugs exhibit highly sensitive environmental reactions: phototaxis, chemotaxis and thermotaxis. Although many studies have investigated how Dictyostelium slugs move toward a light source, the mechanism of phototaxis is still unclear. It has been known that slugs turn towards the light at the anterior end. In addition, previous research identified mutations and drug treatments that interfere with phototaxis but the strategy for analyzing phototaxis has been limited to low resolution both temporarily and spatially. In this thesis methods have been developed to analyze phototactic behavior on two different scales, the slug level and cellular level. The analyses revealed dynamic features of slug behavior during phototaxis which have not been previously described. Following light irradiation slugs moved with approximately 50% higher speed; they showed prominent serpentine movement of their tip as if they were scanning and correcting migration direction; they elongated and decreased the diameter of their body; and their tip remained lifted off the substrate for long periods. The analysis of cell movement during phototactic turning showed that the cell movement pattern was unlike any predicted from earlier hypotheses. Some cells in the anterior zone moved away from the light source across the slug, thus increasing the volume on the “dark” side (“asymmetric cell accumulation”) and bending the anterior zone like a lever-arm toward the light source. Furthermore, it was discovered that light irradiation enhances secretion of cyclic AMP from the slug and that light interferes with cyclic AMP cell-cell signaling during other multicellular stages as well. A model for phototaxis has been proposed based on these results. Laterally irradiated light is focused on the distal side of the slug by a lens effect and locally induces cyclic AMP release. Some cells accumulate chemotactically on the side away from the light source and cause a bending of the anterior zone towards the light source. Since cell movement within the slug is organized by cyclic AMP waves, light induced cyclic AMP release interferes with the endogenous signaling pattern. The consequence is an overall change in the shape and the behavior of slug. The mechanism by which light induces the release of cyclic AMP from slug cells may involve a histidine kinase phosphorelay pathway, since such a pathway is known to be functional in Dictyostelium and is used for environmental responses in many other organisms.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Netzhautfeinstruktur der Europäischen Sardelle Engraulis encrasicolus und verwandter Heringsfische. Detaillierte licht- und elektronenmikroskopische Strukturanalysen dienen als Grundlage für eine funktionsmorphologische Diskussion - daneben werden auch Fragen zur Evolution und Ökophysiologie der Sardellenretinae, sowie zur Taxonomie der Engraulididae behandelt. Die Europäische Sardelle besitzt zapfenförmige Photorezeptoren mit einer stark vom Grundplan abweichenden Feinstruktur. Lange und kurze Zapfen sind abwechselnd und höchst regelmäßig in langen Zapfenreihen angeordnet. Diese sog. „Polycones“ verlaufen innerhalb des Augenbechers in konzentrischen Ringen um den ältesten und damit am weitesten zentral gelegenen Teil der optischen Furche, wechseln sich mit mehr oder weniger breiten Bahnen normal gestalteter Stäbchen ab und sind in charakteristischer Weise mit keilförmigen Ausläufern des Pigmentepithels (PE) verzahnt. Die langen Zapfen reichen weit zwischen die PE-Keile, die Außenglieder der benachbarten kurzen Zapfen werden dagegen von den Spitzen der Keile partiell in zwei Lappen gespalten. Das distale Membran-faltensystem der Sardellenzapfen ist radial ausgerichtet, d.h. gegenüber dem „Normalfall“ um 90° gekippt. Damit werden die Zellen strukturbedingt selektiv empfindlich für die Schwingungsrichtung des axial einfallenden Lichtes. Die Membranfalten der beiden Zapfentypen stehen zudem senkrecht zueinander - eine funktionelle Kopplung ergäbe einen 2-Kanal-Analysator für linear polarisiertes Licht. Die PE-Zellen bilden ein eigentümliches Tapetum lucidum: Höchst regelmäßig ausgerichtete Guaninreflektoren formen einen Interferenz-Keilspiegel in unmittelbarer Nähe der Zapfenaußenglieder. Die Kartierung der Photorezeptoren innerhalb einer Retina zeigt ein Gebiet erhöhter Zapfendichte im ventro-temporalen Quadranten - eine sog. „Area temporalis“ - das eine maximale Sehschärfe im vorderen oberen Sehfeld garantiert. In diesem Bereich befinden sich auch besonders präzise gestaltete Polycone-Zapfen, die die modalitätsspezifische Struktur für die Perzeption scharfer Polarisationskontrastbilder darstellen können. Die Proportionen der Zapfenabschnitte variieren zwischen Area und Fundus, ebenso die Guaninausstattung der PE-Zellen - zudem tritt ein bisher unbekanntes Muster von Dreifachzapfen am dorsalen und ventralen Retinarand auf. Die Übergangsregion zu den Polycones und auch der Retinarand geben Hinweise auf die Morphogenese der Vielfachzapfenreihen und der senkrecht stehenden Membranfalten, vor allem bezüglich der langen Zapfen. Das regelmäßige Muster der skleralen Abschnitte der Photorezeptoren von E. encrasicolus setzt sich auch vitreal der äußeren Grenzmembran fort. Die synaptischen Zapfenfüße bilden in der äußeren plexiformen Schicht eine Art „Schachbrettmuster“, wobei die Terminalen eines Zapfentyps benachbarter Reihen über sog. „Telodendriten“ miteinander verbunden sind. Sie unterscheiden sich bei den langen und kurzen Zapfen in charakteristischen Strukturmerkmalen: die Füßchen der kurzen Zapfen enden weiter vitreal als die der langen. Letztere haben zwei Gruppen von „synaptic ribbons“, während bei den kurzen Zapfen keine eindeutige Gliederung in Synapsenfelder festzustellen ist. Aufgrund der radialen Lage und der Zellmuster können drei Typen von Horizontalzellen unterschieden werden. Für eine H1-Zelle wurde der Versuch unternommen, ihre Verschaltung mit den Zapfen darzustellen: diese Zelle ist spezifisch mit Pedicles der langen Zapfen verbunden und gibt damit einen Hinweis auf eine Trennung von e-Vektor-spezifischen Informationskanälen. Ferner ist bei der Sardelle ein Bipolarzell-Typ mit einem Dendritenfeld ungewöhnlicher Geometrie zu finden. Es folgt offensichtlich dem Reihenmuster der Photorezeptoren. Neben der Europäischen Sardelle wurde auch von anderen Vertretern der Heringsartigen die Struktur und das Muster der Photorezeptoren und der Pigmentepithelzellen bestimmt. Die Ergebnisse liefern Daten, die Aussagen über die Verbreitung und Evolutio n der aberranten Polycone-Strukturen innerhalb der Engraulididae gestatten - darüberhinaus geben sie Anlaß, eine neue Feingliederung der Engraulididae vorzuschlagen. Neben wenigen „Ausreißern“ lassen sich zwei Fischgruppen unterscheiden: eine mit Polycones in Verzahnung mit dem PE und eine mit guaninhaltigen PE-Vorhängen zwischen den Zapfenreihen und ohne Guaninplättchen. Die erste Gruppe wird als Kerngruppe der Engraulidinae verstanden, die zweite dürfte näher mit den Coiliinae verwandt sein.

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären. Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert. Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen ausführlich dargestellt.

Sensillen sind „Kleinsinnesorgane“ der Arthropoda, die die Wahrnehmung einer Vielzahl unterschiedlicher Reize ermöglichen. Trotz großen Interesses an diesen Sinnesorganen ist die Frage nach den Homologieverhältnissen und der Evolution von Sensillen weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit werden daher die antennalen Sensillen von Larven aller größeren monophyletischen Gruppen der Diptera, sowie einiger mit den Diptera verwandter Holometabola raster- und transmissionselektronenmikroskopisch untersucht und vergleichend beschrieben. Die larvalen Antennen der Holometabola sind vor allem wegen der verhältnismäßig kleinen Anzahl von Sensillen besonders geeignete Modellobjekte, da dies die ultrastrukturelle Analyse des jeweils gesamten Sensilleninventars der Antennen ermöglicht. Obwohl die REM-Untersuchung der larvalen Antennen eine enorme äußere Vielfalt an Sensillenformen offenbart, zeigt die Analyse der inneren Ultrastruktur, daß die antennalen Sensillen von insgesamt 32 Dipterenarten und vier holometabolen Außengruppenvertretern nach strukturellen Kriterien nur zehn unterschiedlichen Sensillentypen zugeordnet werden können. Darüber hinaus lassen „modalitätsspezifische Strukturen“ Rückschlüsse auf die Funktionen der Sensillen zu. So deuten die Befunde darauf hin, daß es sich bei den Sensillentypen um olfaktorische, kontaktchemosensitive, gustatorische, thermo-, hygro- bzw. thermo-/hygrosensitive Sensillen, sowie um mechanosensitive Extero- und Propriorezeptoren handelt. Die Ergebnisse zeigen also, daß die larvalen Antennen, obwohl sie bei den Diptera durchschnittlich nur mit etwa zehn Sensillen ausgestattet sind, über ein ähnlich breites Spektrum der Reizwahrnehmung verfügen wie die imaginalen Antennen, die einige hundert oder gar tausend Sensillen besitzen. Rasterelektronenmikroskopisch konnten vor allem äußerliche Anpassungen der Antennen und Sensillen z.B. an Habitat und Lebensweise der Larve nachgewiesen werden; so sind lange Antennen, und mit ihnen meist auch überwiegend langgestreckte Sensillen, in aquatischen Lebensräumen eindeutig begünstigt, während terrestrisch lebende Larven, besonders in festen Substraten, wie z.B. Holz, eher kurze oder sogar plattenförmig reduzierte Antennen besitzen. Die vergleichende TEM-Untersuchung zeigt jedoch auch, daß Sensillen des gleichen Typs bei den jeweiligen Tieren sowohl in ihrer Position auf den Antennen, als auch in ihren strukturellen Merkmalen übereinstimmen. Nach dem Lagekriterium und dem Kriterium der spezifischen Qualität konnte so die Homologie einzelner antennaler Sensillen der Dipterenlarven für die gesamte Ordnung und teilweise sogar für die Holometabola wahrscheinlich gemacht werden. Über diesen homologen Sensillensatz hinaus konnte gezeigt werden, daß individuelle Sensillen - also kleinste Sinnesorgane - evolutiven Veränderungen unterliegen, die es erlauben ihr Schicksal im Verlauf der Phylogenese zu verfolgen. So belegen die Ergebnisse beispielsweise, daß der antennale Kontaktchemorezeptor „Peg“, bei den cyclorrhaphen Fliegen im Zusammenhang mit der Evolution des Antennen-Maxillar-Komplexes zum Maxillarpalpus verlagert wurde. Bei der vergleichenden Analyse aller antennalen Sensillen waren evolutive Tendenzen feststellbar, die in vielen Punkten mit den etablierten Stammbäumen der Diptera übereinstimmen, aber auch interessante Anregungen für derzeit noch ungeklärte Verwandtschaftsbeziehungen liefern. Für die meisten monophyletischen Gruppen der Diptera fanden sich charakteristische Merkmalskombinationen, die teilweise sogar als Synapomorphien gedeutet werden können. Bezogen auf offene Fragen der Dipterensystematik legen die Sensillenmerkmale beispielsweise ein Schwestergruppenverhältnis zwischen den Anisopodidae (Fenstermücken) und den „orthorrhaphen Fliegen“ nahe, wobei eine enge Verwandtschaftsbeziehung vor allem mit den Tabanomorpha (ohne die Vermileonidae) wahrscheinlich ist. Darüber hinaus führte ein Außengruppenvergleich zwischen den Diptera und einigen anderen Holometabola zu dem Ergebnis, daß der „Cone“ als Komplexchemosensillum ebenso zu den Grundplanmerkmalen holometaboler Insektenlarven gehört, wie zwei Thermo-/Hygrorezeptoren (lS3-Sensillen). Das bedeutet, daß diese individuellen Sensillen über fast 300 Mio. Jahre Evolution bis ins frühe Perm zurückverfolgt werden können.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.