Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19 Archiv

Die Destabilisierung des humanen Immunsystems stellt für polytraumatisierte Patienten ein relevantes Problem dar und manifestiert sich auf der Ebene von Organfunktionsstörungen mit nach wie vor erheblicher Letalität. Zahlreiche Untersuchungen der jüngsten Vergangenheit haben klare Hinweise dafür gegeben, daß den zellulären Komponenten des Immunsystems eine zentrale Rolle für die Ausbildung und Ausprägung des posttraumatischen Multi-Organ-Dysfunktions-Syndroms (MODS) und des Multi-Organ-Versagens (Multiple Organ Failure, MOF) zukommt. Dabei hat sich die Fähigkeit monozytärer Zellen auf einen pathologischen Stimulus reagieren zu können, als einer der kritischen Funktionsparameter des menschlichen Immunsystems gezeigt. Die umfangreichen Untersuchungen der jüngsten Vergangenheit konnten jedoch die Frage nach der Dynamik dieser Funktionsstörung bislang nur unzureichend beantworten. Darüber blieb die tatsächliche Synthese-Kapazität relevanter Botenstoffe, wie z.B. von Zytokinen auf intrazellulärem Niveau weitgehend uncharakterisiert. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es daher: i) Die intrazelluläre Zytokinsynthese-Kapazität von Monozyten polytraumatisierter Patienten in der direkten posttraumatischen Phase mittels Durchflußzytometrie zu quantifizieren ii) Zu analysieren, ob es einen Zusammenhang zwischen der intrazellulären Aktivierung der Zytokinsynthese-Kapazität und der Änderung der systemischen Zytokin-Konzentration gibt iii) Die dabei gewonnenen Ergebnisse in Vergleich zu klinischen Parametern zu setzen Da es bislang keine validen Versuchsprotokolle für die durchflußzytometrische Analyse der intrazellulären Zytokinsynthese-Kapazität von Monozyten gab, wurden in der ersten Stufe der vorliegenden Studie die Kulturbedingungen für die Stimulation, Sekretionsblockade und Stimulationszeit von Monozyten erarbeitet. Es zeigte sich, daß im Hinblick auf die weitere Fragestellung die Stimulation mit Lipopolysaccharid über 4 Stunden unter einer Sekretionsblockade mit Monensin valide Ergebnisse erbringt. In der zweiten Stufe der Studie wurde erstmalig mittels intrazellulärer single cell Analyse die Synthese-Kapazität von Entzündungs-relevanten Mediatoren (TNF-, Il-1, Il-6 und Il-8) bei polytraumatisierten Patienten untersucht. Gemäß einem seriellen Protokoll wurde zu den Zeitpunkten „Aufnahme in den Schockraum“, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Trauma bei 13 polytraumatisierten Patienten (ISS >16 Punkte, zwölf überlebt, einer verstorben) jeweils die Zytokinsynthese-Kapazität analysiert. Für TNF- beträgt sie bei Aufnahme 78±5%, für Il-1 ergab sich mit 73±6% ebenso wie für Il-6 mit 58±4%bereits bei Aufnahme eine signifikante Reduktion im Vergleich zur Kontrollgruppe. Es konnte gezeigt werden, daß die Synthese-Kapazität für diese essentiellen proinflammatorischen Zytokine zwischen 12 und 48 Stunden nach Trauma mit 49±5% für TNF-, 53±7% für Il-1, 36,7% für Il-6 und 77,3% für Il-8 signifikant im Vergleich zu den Werten bei Aufnahme reduziert ist. Die vorliegende Untersuchung demonstriert somit eine engmaschige Analyse und Quantifizierung der monozytären Zytokinsynthese-Kapazität für TNF-, Il-6, Il-1 und Il-8 nach Polytrauma. Bezüglich der Analyse, ob ein Zusammenhang zwischen intrazellulärer Aktivierung der Zytokinsynthese-Kapazität und der Änderung der systemischen Zytokin-Konzentration besteht, konnten wir mittels ELISA in der systemischen Zirkulation zwar tendenzielle Veränderungen der einzelnen Faktoren beobachten, jedoch fand sich auf Grund der niedrigen Sensitivität der ELISA-Methode keine signifikante Korrelation zu den hoch-sensitiven intrazellulären Ergebnissen. Bezüglich des Einflusses klinischer Faktoren auf die intrazelluläre Zytokinsynthese-Kapazität ließ sich nachweisen, daß Patienten mit schwerer Verletzung (ISS ≥34) im Zeitraum zwischen 24 Stunden und 72 Stunden nach Trauma eine signifikant niedrigere Zytokinsynthese-Kapazität aufweisen als weniger schwer verletzte Patienten (ISS

Das multiple Myelom ist eine Erkrankung, bei der terminal differenzierte Plasmazellen das Knochenmark infiltrieren, wodurch das typische klinische Bild eines Myelompatienten zustande kommt. In den letzten Jahren haben sich die Hinweise gehäuft, dass die Bindung der Myelomzellen im Knochenmark an Stromazellen die Chemosensitivität der Myelomzellen vermindert und somit zur „de-novo drug resistance" beiträgt. Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, ein Zellmodell zu entwerfen, mit welchem die Untersuchung der Interaktionen von Stromazelle und Myelomzelle und damit der zelladhäsionsabhängigen Zytostatikaresistenz (CAM-DR) möglich ist. Darüber hinaus sollte diese Zytostatikaresistenz charakterisiert und mögliche molekulare Therapietargets identifiziert werden, welche eine Verhinderung von CAM-DR ermöglichen. Da das etablierte Kokulturmodell auf einer Kultur mit der Stromazelllinie HS-5 beruhte, wurde diese zuerst bezüglich der Oberflächenmarker und des Apoptoseverhaltens charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass sich primäre Stromazellen aus Knochenmarksspiraten und die Stromazelllinie HS-5 zwar in ihrer Chemosensibilität unterscheiden, sie prinzipiell jedoch gleich reagieren. Beide lösen bei einer direkten Kokultur mit Myelomzellen im selben Maße CAMDR in den Myelomzellen aus. Die anschließende Charakterisierung von CAM-DR bewies, dass CAM-DR nicht zelllinienspezifisch und nicht zytostatikaspezifisch ist. HS-5-Zellen verhinderten nicht nur die Entstehung von später sondern auch von früher Apoptose. Es zeigte sich, dass das Ausmaß von CAM-DR maßgeblich von der Dauer der Kokultivierung abhängt. Des Weiteren stellte sich heraus, dass in diesem Zellmodell die von den HS-5-Zellen sezernierten Zytokine keinen Einfluss auf die Apoptoseinduktion hatten. Konsequenterweise wurden die Oberflächenantigene auf den Myelomzellen und den Stromazellen quantifiziert und teilweise deren Alteration nach einer Inkubation mit Zytostatika festgestellt. Sowohl eine Blockade der wichtigsten Integrine VLA-4 und LFA-1 als die Modulation der wichtigsten Signalwege konnte CAM-DR zwar teilweise, aber nicht vollkommen verhindern. Allein Vertreter der Statine, Simvastatin und Lovastatin, konnten CAM-DR drastisch reduzieren. Wie weiterhin gezeigt werden konnte, lag dies nicht an einer verminderten Expression von Oberflächenintegrinen, einer verminderten Zytokinsekretion der Stromazellen oder einer verstärkten Deadhäsion der Myelomzellen von den Stromazellen, sondern an der Hemmung der Geranylgeraniolpyrophosphatsynthese. Wir wiesen nach, daß Statine in der Kokultur über die Hemmung des HMG-CoA-Reduktase/GG-PP/Rho/Rho-kinase-Signalwegs wirken. Dies wurde in weiteren Experimenten, in denen selektiv die Geranylgeranioltransferase mittels GGTI-298 und die Rho-Kinase mit Y-27632 gehemmt wurden, bestätigt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können als Grundlage für einen potentiellen Einsatz von Statinen in der Therapie des multiplen Myeloms dienen, denn bezüglich des dargestellten Signalwegs wirken die Statine bereits im subtoxischen Bereich. Die weitere Erforschung von CAM-DR und deren assoziierte Signalwege bei anderen Tumorentitäten sowie die Evaluation der klinischen Relevanz der Gabe von Statinen zur Blockade von CAM-DR ergeben sich als wichtige nächste Schritte als Konsequenz der vorliegenden Arbeit.

Die Osteoporose ist eine der bedeutendsten Erkrankungen des Haltungs- und Bewegungsapparates. Jede dritte Frau und jeder vierte Mann in Deutschland erkranken an Osteoporose. Diese Zahl wird in Anbetracht der demografischen Entwicklung in den kommenden Jahrzehnten noch deutlich ansteigen. Bis zu 95% aller Personen, die eine Fraktur erleiden, werden im Rahmen ihrer ambulanten oder stationären Versorgung nicht bezüglich einer Osteoporose evaluiert. Ziel der Studie war ein Osteoporosescreening bei Krankenhauspatienten durchzuführen sowie der Vergleich der Knochendichte von Diabetikern und einer gesunden Kontrollgruppe. Die Messung der Knochendichte wurde mit quantitativer Knochenultrasonometrie an den Fingern II bis V, der nicht–dominanten Hand, durchgeführt (DBM Sonic Bone Profiler, Firma I.G.E.A. Idar – Oberstein). Gleichzeitig wurde das für die Messungen verwendete Gerät, der I.G.E.A. Bone Profiler bezüglich seiner Eignung zu Screening–Untersuchung im klinischen Alltag getestet. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten im Alter zwischen 50 und 70 Jahren eine signifikant niedrigere Knochendichte aufweisen als ein gesundes Referenzkollektiv. Bei den Patienten mit Diabetes mellitus hatten die Typ2-Diabetiker im Vergleich zum gesunden Referenzkollektiv und zu den Typ1-Diabetikern signifikant niedrigere Knochendichtewerte. Screeningverfahren zur Osteoporoseprophylaxe sind also nicht nur bei Risikogruppen, wie z.B. Diabetikern notwendig, sondern für die überwiegende Mehrheit des Krankenhauskollektivs von Bedeutung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass praktikable Untersuchungsverfahren, wie die Ultrasonometrie, für den klinischen Alltag zur Verfügung stehen.

Ziel dieser Arbeit ist es, den derzeitigen Kenntnisstand der Neuroanatomie, Neurophysiologie sowie der Neuropsychologie zusammenzutragen bzgl. der Praxie und damit verbunden der Dyspraxie, aber auch Apraxie und damit zusammenhängend des motorischen Lernens und der Gedächtnisausbildung. Erst dadurch kann schließlich das Störungsbild der Dyspraxie und Apraxie mit den verschiedenen Ursachen, neuroanantomischen Korrelaten und Symptomen verständlich aufgezeigt werden. Durch die deskriptive Darstellung der motorischen Entwicklung im Kindesalter werden zudem die Voraussetzungen geschaffen, entwicklungsbedingte Bewegungsstörungen frühzeitig zu erkennen und in ihrer gesamten Symptomatik zu verstehen. Durch klare Begriffsdefinitionen sollen Verunsicherung stiftende Fehlverwendungen der Diagnosen Entwicklungsdyspraxie, Syndrom des ungeschickten Kindes und entwicklungsbedingte Koordinationsstörung zukünftig vermieden werden. Gezielte Untersuchungen zum Ausschluss anderer Ursachen der Symptomatik bei betroffenen Kindern ermöglichen den Einsatz einer frühzeitigen, effizienten Therapie, um den Kindern damit das optimale Ausschöpfen der ihnen gegebenen Begabungen zu ermöglichen.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, inwiefern die Einführung des pauschalierten Entgeltsystem in Deutschland (G-DRG-System) die Erlösstruktur eines Krankenhauses der Maximalversorgung im Vergleich zu dem bisherigen Abrechnungssystem nach Bundespflegesatzverordnung verändern kann. Anhand der Daten sollte abgeleitet werden, ob ein 24-stündig einsatzbereites Team und die Bereitstellung eines chirurgischen Schockraumes sowie die Versorgung von polytraumatisierten und kritisch kranken Patienten finanzierbar ist. In einer prospektiven Längsschnittstudie wurden anhand des Traumaregisters der Chirurgischen Klinik, Klinikum Innenstadt der Ludwig-Maximilians-Universität München, 411 Patienten, die innerhalb von zwei Jahren über den Schockraum aufgenommen wurden erfasst. Erhoben wurden neben persönlichen Daten, die Anzahl der Tage des Gesamtaufenthaltes, des Aufenthaltes auf Intensiv- und Normalstation, die Anzahl der Beatmungsstunden, der Verletzungsmechanismus, Glasgow Coma Scale, systolischer Blutdruck, Atemfrequenz sowie alle Diagnosen und durchgeführten Prozeduren. Zur Beurteilung der Verletzungsschwere erfolgte die Ermittlung des ISS-Wertes. Die Diagnosen und Prozeduren wurden nach ICD-10-GM 2005 bzw. OPS 301 SGB V verschlüsselt. Die Erlöse nach Tagessätzen konnten aus den Rechnungen, die an die Krankenkassen gestellt worden waren, entnommen werden. Die Handbücher der Australian Refined-Diagnosis Related Groups Version 4.1 Band 1-3 galten als Vorlage für die Kodierung für das australische DRG-System. Anhand der in diesen Bänden vorgegebenen Entscheidungsbäume wurde jedem einzelnen Patienten eine DRG zugeordnet. Die Gruppierung für das deutsche DRG-System für das Jahr 2003 und 2005 erfolgte mittels einer Grouper-Software. Nach entsprechender Kodierung erfolgten Ermittlung und Vergleich der Erlöse für speziell ausgewählte Patientengruppen und DRGs, nach Tagessätzen, Australian Refined-Diagnosis Related Groups und German Diagnosis Related Groups der Version von 2003 und 2005. Bei der Betrachtung des Gesamtpatientenkollektivs konnte mit dem G-DRG-System von 2003 ein Mindererlös von 3 % und mit dem G-DRG System von 2005 ein Mehrerlös von 16 % gegenüber den tatsächlichen Einnahmen nach Tagespflegesätzen erzielt werden. Die Berechnung der Erlöse nach dem australischen System ergab einen Mehrerlös von 36 % gegenüber den Tagespflegesätzen. Vergleicht man die Erlösberechnung zwischen den Jahren 2003 und 2005 im deutschen DRG-System, so wurden für 2005 zusätzliche Einnahmen von 20 % ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen auf, dass mit dem G-DRG-System für das Jahr 2005 für polytraumatisierte Patienten im Vergleich zu den Tagessätzen ein Mehrerlös von 44,2 % erzielt wurde. Der Mehrerlös für 2003 lag bei 0,6 % und der Mehrerlös nach dem australischen System bei 22,3 % im Vergleich zu den Tagessätzen. Trotz der in der vorliegenden Arbeit festgestellten Erlöszunahme für polytraumatisierte Patienten im G-DRG-System 2005, können alle Kosten, welche für die Versorgung eines Polytraumas anfallen, mit dem pauschalierten Entgeltsystem nicht abgedeckt werden. Dies belegen Studien, welche einen direkten Kosten-Erlös-Vergleich durchgeführt haben. In einer aktuellen Arbeit aus München von Billing et al.2 wird bestätigt, dass mit dem DRG-System von 2005 erhebliche Einbußen bei der Versorgung von Schwerstkranken auftreten. In Anbetracht dieser aktuellen Studienlage zu den kalkulierten Kosten der Versorgung von Schwerstverletzten zeigt sich eine Diskrepanz zum derzeitigen Entgeltsystem. Wegen der Komplexität der Fälle erscheint es fast unmöglich, derzeit einen adäquaten Pauschalbetrag für einen polytraumatisierten Patienten festzulegen. Zur Versorgung schwerstkranker und polytraumatisierter Patienten wären, wie von Haas et al.9 angestrebt, spezialisierte Traumazentren in Zukunft denkbar, wo durch die Kostenbündelung eine adäquate Erlösstruktur erzielt werden könnte.

Die beiden Pathogen-assoziierten molekularen Muster, CpG-Oligonukleotide, als Imitate bakterieller DNA, und LPS, sind in der Lage, das menschliche Immunsystem zu stimulieren. Vor Entdeckung der Toll-like Rezeptoren konnte nicht zwischen direkten und indirekten Effekten von CpG-Oligonukleotiden und LPS auf Zellen des menschlichen Immunsystems unterschieden werden. Durch die Entdeckung der Toll-like Rezeptoren und vor allem die Charakterisierung von TLR9 als Rezeptor für CpG und TLR4 als Rezeptor für LPS entstand die Möglichkeit, die Zielzellen von PAMPs an Hand der Expression der dazugehörigen Rezeptoren zu definieren. Dendritische Zellen sind im Immunsystem des Menschen essenziell für die Auslösung einer Immunantwort. Sie sind in der Lage, eindringende Pathogene an Hand von PAMPs schnell und sicher zu erkennen, und daraufhin eine passende Immunantwort zu initiieren. Zwei Subpopulationen von dendritischen Zellen konnten kürzlich im peripheren Blut identifiziert werden: Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) und myeloide dendritische Zellen (MDC). In der vorliegenden Arbeit wurden die Unterschiede zwischen PDC und MDC in ihren Reaktionen auf CpG-Oligonukleotide, LPS und CD40 Ligand charakterisiert. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass nur PDC und nicht MDC direkte Zielzellen von CpG-ODN im humanen Immunsystem darstellen, während LPS MDC aktiviert, jedoch nicht PDC. Damit konsistent konnte auf molekularbiologischer Ebene nachgewiesen werden, dass PDC TLR9 exprimieren, jedoch nicht TLR4, während MDC den für die Erkennung von LPS notwendigen Rezeptor TLR4 besitzen, aber TLR9 nicht exprimieren. In gemischten Populationen reagierten auch myeloide dendritische Zellen auf CpG-Oligodesoxynukleotide, was auf eine indirekte Aktivierung durch plasmazytoide dendritische Zellen hinweist. PDC reagierten nach Stimulation mit ODN 2006 mit einer Hochregulation von Reifemarkern und kostimulatorischer Moleküle, der Expression von Chemokinrezeptoren, der Produktion proinflammatorischer Chemokine und einer verminderten Apoptoserate. Nach Stimulation mit ODN 2216 sezernierten sie große Mengen IFN-α, während ODN 2006 für die Induktion von IFN-α eine Kostimulation mit CD40 Ligand benötigte. Weder ODN 2006, ODN 2216 oder CD40 Ligand alleine waren in der Lage, IL-12 in PDC zu induzieren, die synergistische Stimulation von PDC mit CpG-ODN und CD40 Ligand führen jedoch zur Produktion großer Mengen an IL-12. Unter optimaler Stimulation mit ODN 2006 und CD40 Ligand können PDC damit gleichzeitig IL-12 und IFN-α produzieren. Das Verhältnis der produzierten Zytokine ist dabei abhängig vom Differenzierungsgrad der PDC. Durch zunehmende Ausreifung der PDC mit IL-3 verschiebt sich nach der Stimulation das Produktionsverhältnis an sezernierten Zytokinen zugunsten von IL-12. Ausreifung mit ODN 2006 ermöglicht PDC, zudem naive allogene CD4 Zellen zu aktivieren, und induziert in Kokulturen IL-12-abhängig ein Th1-gerichtetes Zytokinprofil in den CD4 T-Zellen. IFN-α schien dabei eine geringe Rolle zu spielen. Durch die Charakterisierung der PDC als TLR9-tragende Zielzelle für CpG-DNA, trägt diese Arbeit entscheidend dazu bei, die PDC als Schlüsselzelle für die physiologischen Wirkungen von TLR9-Liganden zu identifizieren und zu verstehen. Dies ist von hoher Relevanz für die Entwicklung therapeutischer Anwendungen von CpG-ODN in der Tumortherapie, Asthmabehandlung, Infektionsprophylaxe und als Adjuvans bei Impfungen.

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, einen Überblick über die Morbidität und Mortalität der sehr kleinen Frühgeborenen mit einem Gestationsalter bis 30 +6 Wochen zu geben, die zwischen 1991 und 2000 in einem großen deutschen Perinatalzentrum geboren wurden. Zusätzlich wurde untersucht, ob sich im Verlauf der Jahre die Häufigkeiten verschiedener Krankheiten veränderten. Dazu wurden retrospektiv die klinischen Daten aller Kinder mit einem Gestationsalter von weniger als 31 Wochen, die auf die Neugeborenenintensivstation des Klinikums Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität aufgenommen wurden, aus den Arztbriefen bis zur endgültigen Entlassung nach Hause gewonnen. Es wurden 674 Frühgeborene mit einer mittleren Schwangerschaftsdauer von 27 +5 Wochen (± 2,0) und einem mittleren Geburtsgewicht von 1018 g (± 314) aufgenommen, von denen 600 Kinder überlebten. Die Mortalitätsraten lagen bei 45% (23 +0-6 Wochen), 31% (24 +0-6 Wochen), 21% (25 +0-6 Wochen), 14% (26 +0-6 Wochen), 6% (27 +0-6 Wochen), 7% (28 +0-6 Wochen), 3% (29 +0-6 Wochen) und 5% (30 +0-6 Wochen). Von den überlebenden Kindern hatten 34% mindestens eine der folgenden schwerwiegenden Komplikationen: 8% eine intrakranielle Blutung Grad III-IV, 6% eine periventrikuläre Leukomalazie, 20% eine bronchopulmonale Dysplasie mit erhöhtem Sauerstoffbedarf im Alter von 36 Schwangerschaftswochen, 6% eine nekrotisierende Enterokolitis und 9% eine Retinopathia praematurorum Grad III-V. 11% der Kinder hatten mindestens zwei und 3% mindestens drei dieser schweren Erkrankungen. Anhand des Chi-Quadrat-Tests auf Trend ergab sich keine signifikante Änderung der Mortalitätsrate im Verlauf der Jahre. Auch die Häufigkeit der verschiedenen Krankheiten nahm außer bei einer intrakraniellen Blutung und einem schweren Atemnotsyndrom nicht signifikant ab.

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen bereitet immer noch Probleme. Auf Grund ihrer geringen Größe und ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist aufwendig und insbesondere aus dem Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle Mikrosporidienarten können in Zellkulturen angezüchtet werden. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR sind aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und Spezifität fehlen, da das immunogene Spektrum von Mikrosporidien weitgehend unerforscht ist und somit bis heute die Wahl eines geeigneten Antigens das Grundproblem darstellt. Dabei wäre gerade vor dem Hintergrund aktuell zunehmender HIV-Infektionen zum Beispiel die Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von Mikrosporidien aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden zu verbessern. Als Modellorganismus wurde die kultivierbare Mikrosporidienspezies Encephalitozoon cuniculi gewählt und in der Zellkultur angezüchtet und vermehrt. Aus der Kultur wurden die Sporen von E. cuniculi in hoher Anzahl und Reinheit gewonnen und aus ihnen die mRNA isoliert, um sie mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA zu transkribieren. Mit dieser cDNA wurde eine Genexpressionsbank angelegt, die mit polyklonalen Serum-Antikörpern gescreent wurde, die durch Immunisierung von Kaninchen mit E. cuniculi gewonnen worden waren. Hierbei konnten mehrere Klone identifiziert werden, die immunogene Proteine bildeten. Die Sequenzierung der isolierten Klone und Analyse der cDNA-Sequenzen ergab die vollständige Übereinstimmung mit einer einzigen Konsensussequenz. Durch die Suche in einer Gendatenbank konnte ein Sporenwandprotein als immunogenes Protein identifiziert werden. Des Weiteren war es möglich, mit Hilfe von Deletionsmutanten eine immunogene Domäne auf der gefundenen Sequenz ausfindig zu machen. Schließlich wurde in der Arbeit ein Vorschlag für die Verwendung dieser Sporenwanddomäne als Antigen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests gemacht. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit (a) das immunogene Spektrum von Encephalitozoon cuniculi als im Wesentlichen auf das Sporenwandprotein beschränkt beschrieben, (b) bei dem identifizierten Protein eine immunogene Domäne charakterisiert und (c) dadurch die Voraussetzungen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests bei Mikrosporidieninfektionen verbessert.

Tuberkulum majus Frakturen stellen eine häufige Verletzung bei jungen Patienten dar. Bei OP-Indikation ist die Frage nach der Operationsmethode mit der höchsten Primärstabilität ungeklärt. Es stehen sich hier die Zuggurtungsosteosynthese mittels Drahtcerclage, die Schraubenosteosynthese und die transossäre Naht als die drei Standard-Methoden gegenüber. Ziel der Studie war es, die Primärstabilität dieser drei Operationsverfahren im biomechanischen Experiment zu testen. Außerdem sollte überprüft werden, ob sich frische und formalinfixierte Leichenpräparate in gleicher Weise eignen, um die Primärstabilität von Osteosyntheseverfahren im Bereich des Humeruskopfes zu überprüfen. Die Zuggurtungsosteosynthese stellte sich sowohl bei den frischen als auch bei den formalinfixierten Präparaten als das am höchsten belastbare Verfahren heraus, gefolgt von der Schraubenosteosynthese. Die transossären Nähte erbrachten bei beiden Präparategruppen die niedrigsten Ausrisskräfte. Jedoch waren die durchschnittlichen Ausrisskräfte bei formalinfixierten Präparaten signifikant niedriger als bei frischen Präparaten. Bei der Überprüfung der Versagensmechanismen zeigten sich zwar sowohl bei den frischen als auch bei den formalinfixierten Präparaten bei den jeweiligen Versorgungsmethoden die gleichen Versagensmechanismen, bei der Häufigkeit der einzelnen Versagensmechanismen kam es jedoch z.T. zu erheblichen Unterschieden.

Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine 1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft. Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT, TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA) durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren, wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind. Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.

Die apparativen Probleme, die sich bei einer Exposition von Zellkulturen gegenüber volatilen Giftstoffen und -gasen ergeben, werden im Zuge der Vorstellung einer neuen Expositionsapparatur dargelegt. Anhand von Extraktionsprofilen, die sich bei der Extraktion von Stickstoffdioxid (NO2) ins Kulturmedium ergeben, wird die Apparatur zunächst in zellfreien Versuchen auf deren Reproduzierbarkeit untersucht. Expositionsversuche mit A549 Zellen über unterschiedliche Zeitdauern zeigen die sich verändernde Zellvitalität anhand des Gesamtglutathiongehalts. Anhand der 4-stündigen Begasungsversuche wird eine Dosis-Wirkungskurve aufgestellt. Im Anschluss an diese Expositionsversuche wird in einer weiteren Versuchsreihe nach der Begasung mit NO2 der Nutzen einer Glucocorticoidgabe (Beclomethason und Budesonid) auf die Zellvitalität untersucht.