Optimierung und quantitative Auswertung eines hochsensitiven Reverse Transkriptase-Aktivitäts Assays

Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der
bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive
RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus
einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der
entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur
beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis
mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine
1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit
Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als
Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des
heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie
einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt
sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese
Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im
Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von
RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie
MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation
der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im
Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein
UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft.
Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden
verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am
Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und
ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die
Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen
Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen
Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises
mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt
werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die
Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT,
TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular
Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen
Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA)
durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste
Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit
hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen
werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren
gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests
auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende
Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier
etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht
zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren,
wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind.
Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik
einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren
für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.