Einzelmolekülbasierte Aggregationsanalyse von Alpha-Synuclein und Tau-Protein

Die Synucleinopathien sind eine Gruppe neurodegenerativer
Erkrankungen, die durch pathologische Ablagerungen des Alpha
Synucleins charakterisiert sind. Sie umfassen unter anderem den
Morbus Parkinson, die Demenz mit Lewy-Körperchen, die multiple
Systematrophie und die Lewy Körperchen Variante des auch durch
Ablagerungen des Tau Proteins gekennzeichneten Morbus Alzheimer.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse von
Aggregationsprozessen des Alpha Synucleins durch
einzelmolekülspektroskopische Verfahren und die Entwicklung neuer
Techniken zur Analyse von Koaggregationsprozessen verschiedener
Proteine. Hierzu wurden Synuclein und Tau Proteine rekombinant in
E. coli hergestellt, aufgereinigt, durch Gelelektrophorese und
Western Blot charakterisiert und Aggregationsprozesse unter in
vitro Bedingungen untersucht. Rekombinantes Alpha Synuclein kann
unter bestimmten Bedingungen in vitro zu fibrillären, amyloiden
Strukturen aggregieren. Diese Aggregate ließen sich durch eine
spezifische Änderung der Thioflavin T Fluoreszenz spektroskopisch
nachweisen, mittels Elektronenmikroskopie darstellen, und
zeichneten sich durch partielle Resistenz gegen die Einwirkung der
Serin Protease Proteinase K aus. Durch Einbau von homologen
Sondenmolekülen, die zuvor mit einer fluoreszenten Gruppe kovalent
konjugiert wurden, ließ sich die Fibrillenbildung auch mit
einzelmolekülbasierten, konfokalen, fluoreszenzspektroskopischen
Analyseverfahren wie der Kreuzkorrelationsanalyse und der
SIFT-Methode (engl. Scanning for Intensely Fluorescent Targets)
darstellen. Der Nachweis der Fibrillenbildung war durch die
fluoreszenzspektroskopischen Verfahren 100 fach sensitiver möglich.
Im Vergleich mit nicht amyloidogenen Proteinen wie Beta Synuclein
und Serum Albumin konnte zudem die Spezifität der Aggregation
gezeigt werden. Bei neurodegenerativen Erkrankungen findet sich zum
Teil die Beteiligung mehrerer amyloidogener Proteine am
pathologischen Prozess. Durch die Möglichkeit der simultanen
Anregung verschiedener Fluoreszenzsonden bei verschiedenen
Wellenlängen und der Differenzierung des emittierten
Fluoreszenzsignals konnten Koaggregationsprozesse in heterogenen
Systemen mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie untersucht
werden. Es zeigte sich, dass Alpha Synuclein sowohl mit seinem
Maushomolog, als auch mit den beiden humanen Parkinson-assoziierten
Mutanten A30P und A53T gemischte Fibrillen bildet, während Beta
Synuclein einen hemmenden Einfluss auf die Alpha Synuclein
Fibrillenbildung aufwies. Mit Hilfe des zweifarbigen Systems ließ
sich auch der Anlagerungsprozeß von Alpha Synuclein Monomeren an
vorbestehende, amyloide Alpha Synuclein Aggregate darstellen, was
einen weiteren Einblick in die molekulare Pathophysiologie der
Synucleinopathien bot. Es wird vermutet, dass bereits
Oligomerformationen einen neurotoxischen Effekt besitzen. Die
besondere Sensitivität der konfokalen Einzelmolekülspektroskopie
erlaubte ebenfalls die Detektion von frühen oligomeren Aggregaten
des Alpha Synucleins sowie des Tau Proteins. Es konnte gezeigt
werden, dass Alpha Synuclein bereits auf Oligomerebene heterogene
Aggregate mit dem Tau Protein bildet, was durch die Tatsache, dass
es sich bei beiden um intrazelluläre Proteine handelt, eine
potentielle pathophysiologische Relevanz besitzt. Im Rahmen von
Versuchsreihen zum Einfluss von Liquor aus an verschiedenen
neurodegenerativen Erkrankungen leidenden Patienten, ließen sich
Hinweise auf eine mögliche neuroprotektive Funktion des Liquors
gewinnen. Dieser zeigte nach Gelfiltration in bestimmten Fraktionen
deutlich aggregationshemmende Eigenschaften. Diese Fraktionen
besitzen einen hohen Gehalt an Albumin. Zusammen mit in vitro
gewonnenen Daten, die einen hemmenden Einfluss von Albumin auf die
Aggregation des Alpha Synucleins zeigen, sind dies Hinweise, dass
die protektive Eigenschaft an den Albumingehalt des Liquors
gekoppelt ist. Das diagnostische Potential der entwickelten
Messmethode verdeutlichten parallel durchgeführte Analysen von
Influenza-Impfstoffpräparationen, in denen gezeigt werden konnte,
dass sich Partikel mit unterschiedlichen Oberflächenepitopen auch
in Mischungen differenzieren lassen. Durch den Einsatz von
spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern ließen sich
eindeutig bestimmte Influenzastämme anhand der
Oberflächenepitop-Konfiguration identifizieren. Zusammenfassend
konnte gezeigt werden, dass die konfokale
Einzelmolekülspektroskopie eine äußerst sensitive und
hochdurchsatzfähige Nachweismethode zur Untersuchung der
molekularen Vorgänge im Rahmen der Alpha Synucleinopathien
darstellt, deren Potential sich nicht allein auf die
Grundlagenforschung beschränkt, sondern auch diagnostische
Möglichkeiten beinhaltet und eine neue Methode zur Suche von bisher
noch nicht beschriebenen, pharmakologisch interessanten Strukturen
bietet.