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  3. Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Podcast
  4. Charakterisierung der endosomalen Membranproteine DdLmp B/C aus Dictyostelium discoideum und biochemische Analyse der Stimulierung der bakteriellen Kinase YopO aus Yersinia enterocolitica durch Aktin
Charakterisierung der endosomalen Membranproteine DdLmp B/C aus Dictyostelium discoideum und biochemische Analyse der Stimulierung der bakteriellen Kinase YopO aus Yersinia enterocolitica durch Aktin

Charakterisierung der endosomalen Membranproteine DdLmp B/C aus Dictyostelium discoideum und biochemische Analyse der Stimulierung der bakteriellen Kinase YopO aus Yersinia enterocolitica durch Aktin

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 vor 22 Jahren
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Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische
Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium
Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase
eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer
zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der
CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als
Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder
- mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler
Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die
Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe
zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge
der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte
festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden
weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der
Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt
ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit
genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC
konnte die familientypische Membran-Topologie einer
Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale,
lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf.
Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die
Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln
nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei
DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten.
Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender
Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben
unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine
in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit
Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten
festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der
Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der
praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im
Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der
Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen
Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als
Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch
genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und
nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich
ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin
als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die
aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist
Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels
Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die
native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte
YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für
eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem
C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden.
Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden
Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der
Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase
in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch
weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

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