Untersuchungen zur Organisation der Transkription und DNA-Replikation im Kontext der Chromatinarchitektur im Kern von Säugerzellen

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Fragestellungen zur
funktionellen und dynamischen Organisation des Kerns von
Säugerzellen untersucht. Der erste Teil der Arbeit widmete sich der
Frage, in welchem Zusammenhang die Synthese naszenter RNA mit der
Organisation des Chromatins im Zellkern steht. Dabei wurde speziell
untersucht, ob naszente RNA bevorzugt in chromatinarmen Räumen
lokalisiert, wie es das
Chromosomen-Territorien/Interchromatin-Kompartiment Modell
(CT/IC-Modell)(Cremer und Cremer, 2001) vorhersagt. Diese
Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die stabil eine
Fusion zwischen dem „Green Fluorescent Protein” (GFP) und dem
Histon H2B exprimierten (Kanda et al., 1998). Mit Hilfe dieses
Fusionsproteins kann die Chromatinstruktur sehr gut dargestellt
werden (Sadoni et al., 2001; Zink et al., 2003). Die naszente RNA
wurde in diesen Zellen durch kurze Pulse von BrUTP markiert, das
anschließend durch eine Immunfärbung nachgewiesen wurde. Die
markierten Zellen wurden mit Hilfe hochaufl ösender konfokaler
Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Für die Analyse der
Bilddaten wurde eine Erosionsmethode entwickelt, welche die
Auswertung der Daten unabhängig von subjektiv gewählten
Schwellenwerten ermöglichte. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten
keine bevorzugte Lokalisierung naszenter RNA in chromatinarmen
Bereichen. Damit stützen die Ergebnisse nicht die entsprechenden
Vorhersagen des ICD-Modells. Die hier gewonnenen Ergebnisse stehen
nicht im Einklang mit den Ergebnissen anderer Studien (Politz et
al., 1999; Verschure et al., 1999). Die unterschiedlichen
Ergebnisse sind wahrscheinlich auf unterschiedliche Methoden zur
Darstellung der Chromatinorganisation, beziehungsweise auf
unterschiedliche Methoden zur Bildanalyse zurückzuführen. Eine
weitere Fragestellung, die im Zusammenhang mit der dynamischen
Organisation der RNA-Synthese und RNA-Prozessierung in der
vorliegenden Arbeit untersucht wurde, war wie das
Spleißfaktor-Kompartiment mit Chromatin interagierte. Diese
Interaktion sollte in lebenden „Chinesischen Hamster Ovarien”
(CHO)-Zellen untersucht werden. Speziell sollte der Frage
nachgegangen werden, ob das Spleißfaktor-Kompartiment
unterschiedlich mit funktionell unterschiedlichen
Chromatinfraktionen assoziiert ist. Dafür wurde die DNA dieser
Chromatinfraktionen mit Hilfe von Cy3-dUTP (Zink et al., 1998; Zink
et al., 2003) spezifisch markiert. Das Spleißfaktor-Kompartiment
der lebenden Zellen wurde simultan mit einem hier lokalisierenden
GFP-Fusionsprotein dargestellt (freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Die so markierten
lebenden Zellen wurden mit Hilfe der konfokalen Laserscanning
Mikroskopie aufgenommen. Die Auswertung der Bilddaten ergab eine
generelle enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit
früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin. Dagegen
bestand eine solche Assoziation nicht mit spät-replizierendem und
transkriptionell inaktivem Chromatin. Eine Behandlung der Zellen
mit dem Transkriptions-Inhibitor α-Amanitin zeigte, dass die enge
Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem
und transkriptionell aktivem Chromatin direkt vom Prozess der
Transkription abhängig war. Insgesamt zeigten die Daten zum ersten
Mal, dass es in lebenden Zellen eine definierte Interaktion des
Spleißfaktor-Kompartiments mit funktionell unterschiedlichen
Chromatinfraktionen gibt, die abhängig ist vom Prozess der
Transkription. Ein weiterer dynamischer Prozess im Zellkern, der in
der vorliegenden Arbeit an lebenden HeLa-Zellen untersucht werden
sollte, war der Prozess der DNA-Replikation. Von besonderem
Interesse war hierbei die Frage, welchen dynamischen
Reorganisationen die DNA während der S-Phase unterliegt. Daneben
sollte auch untersucht werden, wie der spezifische
zeitlich-räumliche Verlauf der S-Phase in Säugerzellen koordiniert
wird. Zur Untersuchung dieser Fragen wurde die zu replizierende
oder die naszente DNA lebender Zellen mit fluoreszensmarkierten
Nukleotiden dargestellt. Simultan wurde die Replikationsmaschinerie
mit Hilfe eines GFP-PCNA Fusionsproteins markiert
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso,
MDC, Berlin). Diese Markierungstechniken erlaubten es zum ersten
Mal, direkt die Interaktionen von replizierender DNA und der
Replikationsmaschinerie zu beobachten und zu analysieren. Die
Ergebnisse zeigten, dass die DNA während der S-Phase keine
großräumigen Umlagerungen erfuhr. Nur einige lokal begrenzte
Reorganisationen wurden beobachtet, die sich innerhalb von
Distanzen von weniger als 1 µm abspielten. Die Ergebnisse zeigten
ferner, dass DNA in stabile Aggregate organisiert war, die den
Replikationsfoci entsprachen. 85 % dieser Aggregate, die auch als
subchromosomale Foci bezeichnet werden (Zink et al., 1998),
behielten ihren Replikationszeitpunkt von S-Phase zu SPhase stabil
bei. Während des zeitlichen Fortschreitens der S-Phase schritt die
Replikationsmaschinerie sequentiell durch benachbarte Gruppen von
subchromosomalen Foci. Diese besaßen einen definierten
Replikationszeitpunkt, und lokalisierten an de- finierten
Positionen im Zellkern. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die
spezifische Anordnung von subchromosomalen Foci im Kern, die
während der frühen G1-Phase etabliert wird (Dimitrova und Gilbert,
1999; Ferreira et al., 1997; Sadoni et al., 1999), die
räumlich-zeitliche Organisation der S-Phase determiniert.