Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten Systeme in dem halophilen Archaeon Halobacterium salinarum

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung
der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons
Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen
(HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY
weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich
fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die
vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den
Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme
vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen
der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach
greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung
vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und
Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen
Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen
ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste
Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die
Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin
untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte,
differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz
wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen
Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch
analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft
werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine
Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein
Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale
Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das
Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des
Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und
RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle
Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene
sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten
Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription
einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um
sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H.
salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers.
Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der
Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die
Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde
bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme
konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise
ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien
zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem
regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen
Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche
PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind.
Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H.
salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese
Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das
Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem
Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum
ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut
Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm
bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen
Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855
sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte
Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels
Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B
identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die
Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers
induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große
Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen
Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein
Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die
Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer
veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der
Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens
führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen
Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo
tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.