Aggregationsverhalten des Polyglutaminproteins Ataxin-3 in vitro und in Zellkultur

Neurodegenerative Polyglutamin (polyQ)-Erkrankungen sind durch
neuronalen Zellverlust und die Bildung von intrazellulären
Proteinablagerungen (Aggregaten) charakterisiert, deren Rolle nicht
exakt geklärt ist. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß sie die
Pathogenese reflektieren und untrennbar mit dem Erkrankungsprozeß
verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das polyQ-Protein Ataxin-3
(AT3) untersucht, welches, wenn es einen verlängerten polyQ-Bereich
besitzt, die Spinozerebellare Ataxie 3 (SCA3) hervorruft. Mit Hilfe
von AT3-Deletionsmutanten wurde gezeigt, daß die Entfernung des
N-Terminus von polyQ-verlängertem AT3 zu dessen Aggregation in
vitro, in Hefe und in Neuroblastomazellen führt. Entsprechend löst
die proteolytische Spaltung von pathologischem Volllängen-AT3 die
SDS-resistente Aggregation in vivo aus. Hinweise auf die
Calcium-abhängigen Calpaine als AT3-schneidende Proteasen wurden in
vitro mit Säugetierzell-Lysaten erhalten. Gereinigtes Calpain II
generiert mehrere AT3-Fragmente in vitro, einschließlich
C-terminaler Fragmente, die den polyQ-Bereich enthalten. In
Zellkultur resultiert die Aktivierung von Calpainen in einer
verstärkten AT3-Proteolyse, während eine Inhibition von endogenem
Calpain durch Calpeptin oder Calpastatin zu einer verringerten
AT3-Spaltung und reduzierter Aggregation in Säugerzellen führt.
Zusammenfassend unterstützen diese Daten die "toxic
fragment"-Hypothese, die als Voraussetzung für Pathogenese und
Aggregation von polyQ-Proteinen deren proteolytische Spaltung
postuliert. Toxizität der polyQ-Proteine soll unter anderem aus der
Rekrutierung von anderen zellulären Proteinen wie
Transkriptionsfaktoren, Chaperonen, Ubiquitin und Proteasomen in
die polyQ-Aggregate resultieren. Obwohl Wildtyp-AT3 nicht
selbständig aggregiert, koaggregiert es mit polyQ-verlängertem
AT3-Fragment, was mit einer verringerten AT3-Konzentation in der
Zelle korreliert. Einer Konformationsänderung des Wildtyp-AT3,
induziert von pathologischem polyQ, folgt in vitro eine
Rekrutierung in frühe Aggregationsintermediate und letztendlich die
Integration in stabile Koaggregate. Weitere Experimente zeigten,
daß die Expression der molekularen Chaperone (Hitzeschockproteine)
Hsp70 und Hsp40 zusammen mit polyQ-verlängertem AT3-Fragment die
Aggregation vermindert und den proteasomalen AT3-Abbau in vivo
verstärkt. Das Chaperon p97 (VCP) zeigt eine
konzentrationsabhängige Modulation der Aggregation in vitro.
Schließlich konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß
eine Veränderung der zellulären Lokalisation durch Fusion von
AT3-Konstrukten mit Kernlokalisations- und Kernexportsignalen
keinen Einfluß auf die Aggregationsfähigkeit in Neuroblastomazellen
hat. Das putative endogene Kernlokalisationssignal von AT3 mit der
Sequenz RKRR (282-285) wurde nicht verifiziert.