Molekulare Regulationsmechanismen der Frizzled 8-Transkription in humanen Fibrosarkomzellen und mesenchymalen Stammzellen

Der in der Evolution hochkonservierte Wnt-Signalweg spielt in der
Embryonalentwicklung, der Stammzellbiologie sowie in der Entstehung
von Tumoren eine tragende Rolle. Es werden dabei verschiedene Arten
der Wnt-vermittelten Signalübertragung unterschieden: Einerseits
der sogenannte kanonische, über β-Catenin vermittelte Wnt-Signalweg
und andererseits der Wnt/Ca2+- sowie der planar cell polarity
(PCP)-like-Weg, die beide die Signaltransduktion unabhängig von
β-Catenin übermitteln. Bislang sind die Mechanismen des
Wnt/β-Catenin-Signalweges nur teilweise aufgeklärt, wobei
insbesondere das Zusammenspiel von Wnts, Frizzleds und deren
Korezeptoren auf funktioneller und struktureller Ebene bis heute
nur rudimentär beschrieben wurden. In unserer Arbeitsgruppe konnte
in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden, dass der
Frizzled-8-Rezeptor (Fzd8) in HT1080-Fibrosarkomzellen im
Verhältnis zu den übrigen Fzds sehr stark exprimiert wird und seine
erhöhte Expression mit einer Aktivierung des
Wnt/β-Catenin-Signalweges sowie mit einer erhöhten Invasivität und
Proliferation assoziiert ist (Leitenstern et al., mündliche
Mitteilung). Ferner wurde gezeigt, dass die Expression von Fzd8
durch Wnt3a bzw. den kanonischen Wnt-Signalweg negativ reguliert
wird (Karow 2008; Kolben, Perobner et al. 2012). Vor diesem
Hintergrund sollte nun im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von
Reportergenexperimenten die transkriptionelle Regulation von Fzd8
im Detail untersucht werden. Hierzu wurden die Fzd8-Promotorregion
und verschiedene 5’- und 3’-terminale Verkürzungsvarianten in den
Vektor pGLuc-Basic kloniert, der eine Quantifizierung der
Promotoraktivität mittels des Reporterproteins Gaussia Luciferase
erlaubt. Der Fzd8-Promotor konnte durch dieses Verfahren in
aktivierende und repressive Elemente unterteilt werden, wobei auch
ein putatives Enhancer-Element identifiziert werden konnte. Unter
Wnt3a-Stimulation zeigten alle untersuchten Promotorkonstrukte eine
verringerte Reporterproteinaktivität, was auf eine negative
Regulation von Fzd8 durch Wnt3a hinweist. Interessanterweise aber
führten Manipulationen am Wnt/β-Catenin-Signalweg weiter downstream
zu entgegengesetzten Ergebnissen. So führte ein APC-Knockdown, der
mit einer starken Aktivitätszunahme des Wnt/β-Catenin-Signalweges
einhergeht, zu einer Zunahme der Fzd8-Promotoraktivität. Im
Gegensatz hierzu ging ein Knockdown von β-Catenin, der einer
Inhibierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges gleichkommt, mit einer
verminderten Fzd8-Promotoraktivität einher. Diese Ergebnisse deuten
darauf hin, dass die Wnt3a-vermittelte Repression von Fzd8 auch
unabhängig vom kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg erfolgen könnte.
Des Weiteren wurde die Fzd8-Promotorregion einer in silico-Analyse
mit der Software MatInspector unterzogen, um mögliche
Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die für die
Fzd8-Regulation maßgeblich sein könnten. Dabei zeigte sich, dass
der Transkriptionsfaktor ZF5, der sowohl aktivierend als auch
reprimierend an verschiedenen Promotoren wirken kann, aufgrund des
Verteilungsmusters seiner Bindungsstellen am Fzd8-Promotor als
möglicher Regulator fungieren könnte. ZF5 konnte dabei als putativ
positives Wnt/β-Catenin-Zielgen charakterisiert werden. Es konnte
ferner gezeigt werden, dass Fzd8 indirekt über ZF5 durch den
Wnt/β-Catenin-Signalweg induziert werden kann. Da ZF5 wie auch Fzd8
in HT1080-Fibrosarkomzellen stark exprimiert wird und die
ZF5-Überexpression mit einer Zunahme des Wnt/β-Catenin-Signals
einhergeht, könnte hier ein positiver feedback loop vorliegen.
Somit könnte diese Amplifikation des Wnt/β-Catenin-Signals von
maßgeblicher Bedeutung für die verstärkte Proliferation und
Invasivität von mesodermalen Tumoren sein.