Akrosomale Exozytose von Säugerspermien

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die
Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle
Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte
Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur
Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für
die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der
Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt
induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler
Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von
Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren
akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem
kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten
Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche
Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen
Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen,
ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die
Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch
die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus
SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der
funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in
Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft
werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk
die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple
Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein
die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien
darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare
Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten.
Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als
prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien
identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine
Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der
akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren
konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an
Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert
sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der
SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle
Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro
Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen
kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl
testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das
erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie
einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle
Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion
wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien
verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2,
aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die
Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die
Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle
Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden
Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise
führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration
durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten
Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich
zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine
kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien
exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein.
Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit
isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten
im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der
akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation
eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter
physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur
Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der
Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion
zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete,
großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu
gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte
Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit
dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist
im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran
beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien
im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu
verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl
eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung
weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige,
multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend
Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine
Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie
auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde,
könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale
Exozytose unterstützen.