Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung,
Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur
quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der
Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan
umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der
Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den
Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses
Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich,
dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über
diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin
Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen
Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf
höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und
Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das
Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer
Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden
Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und
Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch
Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von
N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des
gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die
Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist
die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von
Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive
Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der
Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die
der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert.
Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle
in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die
Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des
erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert.
Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive
oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die
neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene
Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver
Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser
Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das
exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein
Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum
Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung
nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite
zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen
neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die
Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des
Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien
können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen
assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker
zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze
postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue
HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte
Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die
Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente
Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie
beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als
Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr
niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für
diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein
sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der
HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst
alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur
einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer
ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die
analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die
Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen
Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der
Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die
Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der
Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher
Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des
Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60%
unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu
starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der
Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich
die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls
unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte
Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt
werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des
Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt.
Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro
Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der
Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway
untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode
besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen
Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen,
neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu
untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen
darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese
unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es
der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die
Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels
zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer
Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit,
Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in
publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert
und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche
Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways
auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch
hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem
Nutzen ist.