Aufbau eines Systems zur Untersuchung peroxisomaler Protein-Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle mittels Biolumineszenz Resonanzenergietransfer

Proteine werden durch Gene kodiert und sind die Vermittler
biologischer Strukturen und Prozesse. Veränderungen der Gene haben
einen Einfluss auf die Struktur und Funktion der Proteine. Zur
Erfüllung ihrer Aufgaben bilden Proteine über
Protein-Protein-Interaktionen (PPI) Komplexe oder
Funktionseinheiten. Diese zu kennen, ist wesentlich für das
Verständnis der Funktion einzelner Proteine im Gesamtkontext und um
den Einfluss von genetischer Variation auf die Proteinfunktion im
Rahmen angeborener Erkrankungen besser einordnen zu können. Bislang
werden PPI einerseits v.a. mit Hochdurchsatz-Verfahren untersucht,
bei welchen die Proteine nicht in ihrer biologischen Umgebung
exprimiert oder in denaturierter Form verwendet werden; dadurch ist
häufig mit Artefakten zu rechnen. Andererseits erfordern die
Verfahren zur in vivo-Untersuchung biologisch relevanter
Interaktionen einen hohen Aufwand. Wir beschreiben in dieser Arbeit
den Aufbau und die Etablierung eines Verfahrens zur in vivo
Hochdurchsatz-Untersuchung von PPI. Dieses beruht auf der
Technologie des Biolumineszenz Resonanzenergietransfers (BRET),
welche durch Optimierung des Prozesses zu improved BRET (iBRET)
hinsichtlich Effizienz, Durchsatz und Validität verbessert wurde.
Dabei wurde die Konstrukt-Klonierung durch Einsatz eines auf
Rekombination basierenden Klonierungssystems beschleunigt und
Effizienz sowie Durchsatz der Transfektion von eukaryonten Zellen
mit Hilfe eines Elektroporationsverfahrens im 96-Well Format
optimiert. Bei der Detektion wurde ein Substrat verwendet, welches
nur von lebenden Zellen verarbeitet werden kann. Die
Signalmessungen erfolgten automatisiert an einem Multiwell
Plattenlesegerät. Die Auswertung wurde durch eine bioinformatische
Methode zur Berechnung von Schwellenwerten für positive
Interaktionen verbessert. Mit dieser Technologie konnte die
Homodimerisierung von PEX26 erstmals beschrieben und
charakterisiert werden. PEX26 ist ein Membranprotein des
Peroxisoms, das am Import von Matrixporteinen in das Peroxisom
beteiligt ist. Bei genetischen PEX26-Defekten kommt es zum
Auftreten von sog. peroxisomal ghosts – dies sind
Membrankompartimente ohne Matrixinhalt. Klinisch kommt es v.a. zu
Erkrankungen aus dem Zellweger-Spektrum, die sich mit einem
unterschiedlichen Schweregrad manifestieren. Anhand von
Trunkierungs-Konstrukten identifizierten wir mittels iBRET die zwei
Interaktionsdomänen für die Homodimerisierung am C-Terminus des
Proteins in der Umgebung der Transmembrandomäne bzw. in der
peroxisomalen Matrix. Diese liegen abseits der für den
Matrixprotein-Import essentiellen Bindedomäne für PEX6, der sich im
zum Zytosol gerichteten N-terminalen Abschnitt von PEX26 befindet.
Neben dem Volllängeprotein PEX26 wurde auch die Splice-Variante
PEX26Δex5 beschrieben, welcher das Exon 5 und damit die
Transmembrandomäne fehlt. Diese Variante ist im Endoplasmatischen
Retikulum (ER) und im Zytoplasma lokalisiert. Wir zeigten, dass
auch sie Homodimere bildet und zudem das Volllängeprotein PEX26
bindet. Sie ist in der Lage, das Fehlen von funktionellem PEX26 in
PEX26-Defektzelllinien zu etwa 50% zu komplementieren, obwohl das
Protein nicht am Peroxisom lokalisiert ist. Dies lässt die
Schlussfolgerung zu, dass sich PEX26 für den Matrixprotein-Import
nicht zwingend am Peroxisom befinden muss. Die physiologische
Funktion der Splice-Variante ist noch nicht aufgeklärt.
Mittlerweile ist bekannt, dass auch PEX26 anteilig im ER
lokalisiert ist und es mehren sich die Hinweise, dass es aufgrund
der Herkunft der Peroxisomen aus dem ER bei deren Biogenese und
Homöostase eine Rolle spielt. Wir führten eine Literaturrecherche
nach Interaktionspartnern von PEX26 und seinem homologen Protein
Pex15p aus der Hefe durch, fanden hier jedoch keinen Hinweis auf
weitere Funktionsbereiche von PEX26. Klar ist jedoch, dass sich die
unterschiedliche Manifestation der Defekte bei den Patienten nicht
allein aus seiner Rolle beim Import von Matrixporteinen ableiten
lässt. Basierend auf der vorliegenden Arbeit könnten Erkenntnisse
aus der derzeit in unserer Arbeitsgruppe umgesetzten Untersuchung
des peroxisomalen Interaktoms zu einem besseren Verständnis der
Funktion von PEX26 und der Fehlfunktion bei PEX26-Defekt beitragen.